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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 质粒共转化求助
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无难事

新虫 (初入文坛)

[求助] 质粒共转化求助 已有1人参与

大家好，我使用pET-28a与pET-22b两个质粒分别携带一个目的基因，然后共转化进BL21，双抗进行筛选。然后一个菌落的菌p我做了两管，1管是pET-28a通用引物+28a质粒上目的基因下游引物，另外1管是pET-22b通用引物+22b质粒上目的基因下游引物。都能p出来，但是诱导的时候发现只有一种蛋白表达，是什么原因呢？
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1楼 2024-11-01 10:10:26
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chen5805

至尊木虫 (职业作家)

资深木虫
不是基因成功连接上表达载体鉴定完毕后都能表达的，基因表达是较复杂的过程，增大诱导剂量及诱导时间或者更换培养基试试~

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2楼2024-11-01 11:44:51
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无难事

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by chen5805 at 2024-11-01 11:44:51
不是基因成功连接上表达载体鉴定完毕后都能表达的，基因表达是较复杂的过程，增大诱导剂量及诱导时间或者更换培养基试试~

您好，谢谢您的回答，我想知道会不会是这两个质粒的问题。不能同时在一个菌株里面表达。
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3楼2024-11-01 13:56:08
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chen5805

至尊木虫 (职业作家)

资深木虫
我们之前是把构建好的不同的表达载体分别转化到表达菌中，没有试过不同的表达载体共同转化到同一种表达菌株中的情况，你可以做对比实验看看；

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4楼2024-11-01 20:44:29
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
怎么确认另外一种蛋白没有表达？  

（在双基因体系中不表达的蛋白）该蛋白单独能表达吗？

2,3，4,5个不同亚基都可以在大肠杆菌中共表达，可以用Duet质粒（一个质粒）

提供信息有限，有可能是小的蛋白过量表达，生成太多mRNA，结合了核糖体，抑制了大蛋白的表达（纯猜）
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行至水穷处，坐看云起时
5楼2024-11-03 13:34:59
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yandz680717

木虫 (正式写手)
这两个质粒不相容，可以用双启动子的pDueT

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6楼2024-11-04 06:22:25
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无难事

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by pennchem at 2024-11-03 13:34:59
怎么确认另外一种蛋白没有表达？  

（在双基因体系中不表达的蛋白）该蛋白单独能表达吗？

2,3，4,5个不同亚基都可以在大肠杆菌中共表达，可以用Duet质粒（一个质粒）

提供信息有限，有可能是小的蛋白过量表 ...

跑了SDS-PAGE看的，只有一种蛋白表达了
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7楼2024-11-04 16:43:20
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 无难事 at 2024-11-04 16:43:20
跑了SDS-PAGE看的，只有一种蛋白表达了...

可能表达失衡，另外一个表达量低而已，可以用更灵敏的方法测试一下（western 或测试酶活性）
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行至水穷处，坐看云起时
8楼2024-11-04 20:14:50
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