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具有可控光疗杀菌特性的多功能丝素/纳米酶复合微针的构建
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【研究背景】 牙周炎是一种高度流行的疾病，影响高达90%的世界人口。高度动态的口腔环境、组织-牙齿“口袋”结构和抗菌药物耐药性对牙周炎局部治疗提出了挑战，迫切需要用先进的生物材料和新的治疗方法进行升级。 上海交通大学医学院蒋欣泉专家团队提出了一种新的牙周炎治疗策略，即纳米酶催化的光/化学动力学灭菌和微针原位给药平台的协同作用。通过在丝素蛋白（SF）生物分子上原位生长单分散的超小CuS纳米酶，然后与甲基丙烯酸化透明质酸（HAMA）杂交，构建了一种可生物降解的多功能光热微针（MN-SF/CuS）贴片。构建的SF/CuS微针可以方便地微创地深入牙周组织而不受唾液的影响，在那里它将热作用，活性氧和铜传递到指定的深度，实现快速灭菌和抑制细菌生长。同时，SF/CuS微针实现了按需光疗效果，而不损伤周围正常组织。临床前大型动物模型证实，SF/CuS微针具有优异的不可逆抗菌活性，并促进组织再生，显著提高牙周治疗的耐受性和依从性。 【研究内容】 微针是一种新兴的局部给药系统，可穿透皮肤、关节、血管等多种部位，已被广泛研究。尽管近年来已取得了许多研究成果，但将其应用于口腔疾病，尤其是牙周组织的研究尚不多见。微针可以以无痛、微创的方式穿透健康牙龈，可以在牙龈沟底部保持高浓度的药物，而不会被唾液冲洗，极大地解决了牙周袋内药物流失的难题。 丝素蛋白（SF）是一种理想的生物生长模板和稳定剂，光刺激响应型CuS纳米粒子由于其固有的金属离子生物功能和光热响应性而在生物纳米药物中得到了广泛的研究。将SF/CuS纳米酶安装到微针系统中，其中光疗将沿着微针内部的孔结构行进并到达深层组织，从而优化光热效应并保持纳米酶的局部保留。 一、SF/CuS微针的构建与表征 SF/CuS微针的构建过程如图1a和1b所示， XRD，XPS谱图（图1f）和FTIR谱图（图1g）表明成功合成了六方相CuS和SF/CuS。 我们进一步研究了各种微针贴片的光热性能，各种微针的光热图像显示，每根针在各种照射强度下都具有优异的光热转换特性而没有任何变形（图2），这有助于MN将光传输到组织的更深层并在指定位置产生热量。微针贴片的多孔结构更有利于光捕获和多重散射，这可以促进其光吸收，因此导致更好的光热转换效率。 固体琼脂实验表明具有良好的生物降解能力。NIR激光照射减缓了MN-SF/CuS和MN-CuS贴片的溶解（图2j），微针的这一特性可以缓解纳米酶在短时间内的突释，增加贴片的工作时间，从而减少无机颗粒的治疗频率和副作用。 二、抗菌和抗生物膜活性的评价 牙龈卟啉单胞菌（P.gingivalis）和具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）（F.有核菌）是牙周炎的主要致病菌。将细菌与CuS或SF/CuS在NIR照射下共培养,结果表明光热效应下的死亡细菌的增加，显示活菌的比例最低。采用扫描电镜和透射电镜观察了细菌的形态。结果表明，CuS和SF/CuS可破坏细胞膜，导致核酸和蛋白质渗漏，最终导致细菌死亡。菌斑生物膜积累在牙周炎中非常常见，CuS和SF/CuS各自能够极大地抑制细菌生物膜形成。 三、通过调节ROS产物和温度促进抗菌 在近红外辐射下，SF/CuS产生的高温不仅破坏了细菌的膜结构，降低了细菌的活性，而且还促进了ROS的产生。同时，产生的活性氧可与受损的细菌细胞膜相互作用，造成细胞膜破裂，诱导蛋白质渗漏，甚至进入细菌内部破坏DNA和细胞器，最终安全高效地杀死细菌。通过物理和化学手段相结合，可以在发挥良好治疗效果的同时，更好地避免细菌耐药性的产生。 四、SF/CuS纳米酶的生物相容性和细胞适应性 牙龈成纤维细胞（gingivalfibroblast，GF）是牙龈组织中的主要细胞。采用CCK-8和钙黄绿素-AM/碘化丙啶（Calcein-AM/PI）染色法评价CuS和SF/CuS与GF细胞的生物相容性。结果表明，SF具有优异的生物相容性，而且使超小CuS纳米酶均匀分布而不聚集。 为了研究SF/CuS的潜在生物学功能，我们进行了全RNA测序，主成分分析（PCA）（图6a）SF/CuS处理的潜在信号传导途径。结果显示，p53在许多生物和病理过程中发挥作用，如免疫反应，代谢和抗氧化防御。总之，这些结果表明SF/CuS纳米酶通过改善p53稳定性、防止p53降解和限制巨噬细胞的铁凋亡从而影响其免疫活性来抑制炎症。 五、犬牙周炎模型的体内疗效 通过丝线结扎和细菌涂布法构建了犬牙周炎模型，评价了各种微针贴剂的体内抗菌和促进组织再生能力。植入后8周，通过重建的三维（3D）和二维（2D）图像评价所有实验组的牙槽骨增加水平（图7 b）。MN-SF/CuS治疗后，牙周组织的骨量和牙槽骨面积均明显增加，说明MN-SF/CuS治疗后牙周炎得到明显改善。表明MN-SF/CuS在近红外照射下可以促进牙槽骨修复并有效治疗牙周炎。 通过VG染色，可以清楚地观察牙齿与其周围牙周组织的接触情况，并可以直接观察牙齿周围牙周骨组织的高度和生长情况。结果显示，MN组骨组织深染红色，骨组织薄，高度低。在颊侧和舌侧，MN-SF/CuS组牙周骨组织的生长和厚度均显著高于MN和MN-CuS组（图7d）。硬组织切片经美蓝染色后，MN-SF/CuS组的牙周骨组织在颊侧和舌侧均有明显的小梁结构，小梁结构粗大而坚固，周围有深蓝色的成骨细胞（图7e）。MN-SF/CuS可显著消除局部组织的细菌侵入，具有良好的抗菌效果，在治疗组织感染方面具有良好的应用前景。 【结论】 本研究成功构建了一种新型光热微针（MN-SF/CuS）贴片，用于基于有机-无机杂化SF/CuS纳米酶性质的深层牙周袋的抗菌治疗和促进组织再生。MN-SF/CuS可以将光靶向传输到组织的更深层，以在NIR照射下实现局部高温和可控的ROS产生。体内外实验结果表明，SF/CuS具有良好的抗菌效果，MN-SF/CuS贴片通过光热效应、POD样活性和铜释放的协同作用，有效地消除了深部组织炎症，促进了组织再生。抗菌机理研究表明，光热作用和产生的活性氧破坏细菌细胞膜，导致蛋白质、核酸等物质的渗漏，杀死细菌，抑制细菌生物膜的形成。 我们的光热微针贴片为未来牙周炎和深部组织炎症的治疗提供了新的视角。 原文链接： https://doi.org/10.1016/j.nantod.2024.102297 |
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