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[求助]
求助，通过CRISPR在内源性基因后边插入GFP已有1人参与
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目的是想内源性基因终止密码子前插入GFP，让GFP和目的基因一起表达 我使用的gRNA质粒是lentiCRISPR-v2，设计了两个gRNA，把两个gRNA中间的序列完全敲除，PAM序列在切除的这一段序列中，所以没有做donor的点突变 donor质粒是pEASY blunt simple cloning kit，选取了两个gRNA左右侧各800bpDNA序列，两端DNA序列中间是P2A-GFP，通过重叠PCR将三个片段P到一起后直接和线性化的载体相连 构好质粒后用lipo3000转染 现在的情况是我师姐也在做这个实验，但是和我用的细胞不一样，她的情况是gRNA位点发生了突变，但没用donor做模板进行修复 我用的是胚胎干，但一直没转进去，所以现在想先换个细胞试下效果，看能不能成功插入GFP，如果能成功再用胚胎干做 有没有大佬知道问题出在哪里  pEASY.png |
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