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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 蛋白激酶胞内结构域原核表达纯化 蛋白质出现在菌体沉淀中该怎么纯化
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fightingbj

新虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白激酶胞内结构域原核表达纯化 蛋白质出现在菌体沉淀中该怎么纯化 已有1人参与

蛋白原核表达不出来，有没有什么办法？
本人最近在做磷酸化实验，目前在纯化一个激酶，将kinase domain（跨膜结构域已去除）的序列构建到GST载体中，200ml培养基的菌体用50ml裂解液重悬破碎后离心，拷染发现蛋白质仅在菌体破碎后的沉淀中检测到，在上清中检测不到，用的是rosetta菌株，有没有大神指导一下这种情况该怎么纯化，非常感谢！
之前也用过pET-28a载体纯化，也是同样的情况。
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心中有爱，为人真善。
1楼 2024-06-07 11:24:33
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5733SQYY

新虫 (初入文坛)
8M尿素溶解后纯化

发自小木虫Android客户端
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2楼2024-07-05 11:22:30
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heylixing

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

从我的经验看，很多激酶都是用昆虫表达系统做的。

首先，从最低的成本角度考虑，查阅文献，看看别人是不是用大肠杆菌系统表达纯化过该激酶。

其次，考染观察到在沉淀中，不代表上清中就一定没有（可能只是可溶表达量低）。
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3楼2024-07-23 16:16:31
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preparation1

银虫 (初入文坛)
调整蛋白表达条件
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4楼2025-12-23 20:37:38
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