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fightingbj

新虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白激酶胞内结构域原核表达纯化 蛋白质出现在菌体沉淀中该怎么纯化 已有1人参与

蛋白原核表达不出来,有没有什么办法?
本人最近在做磷酸化实验,目前在纯化一个激酶,将kinase domain(跨膜结构域已去除)的序列构建到GST载体中,200ml培养基的菌体用50ml裂解液重悬破碎后离心,拷染发现蛋白质仅在菌体破碎后的沉淀中检测到,在上清中检测不到,用的是rosetta菌株,有没有大神指导一下这种情况该怎么纯化,非常感谢!
之前也用过pET-28a载体纯化,也是同样的情况。
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心中有爱,为人真善。
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5733SQYY

新虫 (初入文坛)

2楼2024-07-05 11:22:30
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heylixing

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

从我的经验看,很多激酶都是用昆虫表达系统做的。

首先,从最低的成本角度考虑,查阅文献,看看别人是不是用大肠杆菌系统表达纯化过该激酶。

其次,考染观察到在沉淀中,不代表上清中就一定没有(可能只是可溶表达量低)。
3楼2024-07-23 16:16:31
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preparation1

银虫 (初入文坛)

调整蛋白表达条件
4楼2025-12-23 20:37:38
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