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[交流] 5分钟学会如何设计PCR引物

查找目的基因序列并不能直接用于我们研究所用，因为查找到的基因序列只能算是基因的电子序列，并不是我们研究要用的现实中的序列，如何获得现实的基因序列呢？这就需要我们根据基因的电子序列来设计引物了，通过引物借助PCR方法才能获得我们的目的基因序列。接下来，我们将介绍一下PCR方法并讲述如何设计引物。

PCR（polymerasechainreaction），即聚合酶链反应，又称基因体外扩增技术，是由一对引物介导、能在体外对特定DNA片段进行快速酶促扩增的技术。PCR能把很微量的遗传物质在数小时内扩增数百万倍达到检测水平．使原来无法进行分析和检测的许多项目得以完成。PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。

1、
引物的特异性

引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。

2、
避开产物的二级结构区

某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

3、
长度

寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T）Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性。

4、
G+C含量

G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

5、
碱基随机分布

引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。

6、
引物自身

引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。

7、
引物之间

两引物之间不应有互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。

8、
引物的3′端

引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3′端不能发生错配。在标准PCR反应体系中，用2UTaqDNA聚合酶和800μmol/LdNTP（四种dNTP各200μmol/L）以质粒（103拷贝）为模板，按95℃，25s；55℃，25s；72℃，1min的循环参数扩增HIV-1gag基因区的条件下，引物3′端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。A∶A错配使产量下降至1/20，A∶G和C∶C错七下降至1/100。引物A：模板G与引物G：模板A错配对PCR影响是等同的。

9、
引物的5′端

引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。

10、
密码子的简并

如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。

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