| 查看: 775 | 回复: 5 | |||
[交流]
5分钟学会如何设计PCR引物
|
|||
|
查找目的基因序列并不能直接用于我们研究所用，因为查找到的基因序列只能算是基因的电子序列，并不是我们研究要用的现实中的序列，如何获得现实的基因序列呢？这就需要我们根据基因的电子序列来设计引物了，通过引物借助PCR方法才能获得我们的目的基因序列。接下来，我们将介绍一下PCR方法并讲述如何设计引物。 PCR（polymerasechainreaction），即聚合酶链反应，又称基因体外扩增技术，是由一对引物介导、能在体外对特定DNA片段进行快速酶促扩增的技术。PCR能把很微量的遗传物质在数小时内扩增数百万倍达到检测水平．使原来无法进行分析和检测的许多项目得以完成。PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。 1、 引物的特异性 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。 2、 避开产物的二级结构区 某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。 3、 长度 寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T）Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性。 4、 G+C含量 G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。 5、 碱基随机分布 引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。 6、 引物自身 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。 7、 引物之间 两引物之间不应有互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。 8、 引物的3′端 引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3′端不能发生错配。在标准PCR反应体系中，用2UTaqDNA聚合酶和800μmol/LdNTP（四种dNTP各200μmol/L）以质粒（103拷贝）为模板，按95℃，25s；55℃，25s；72℃，1min的循环参数扩增HIV-1gag基因区的条件下，引物3′端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。A∶A错配使产量下降至1/20，A∶G和C∶C错七下降至1/100。引物A：模板G与引物G：模板A错配对PCR影响是等同的。 9、 引物的5′端 引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。 10、 密码子的简并 如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。 |
回复此楼» 猜你喜欢
求调剂，想在B区上个临床学硕
已经有1人回复
-
天津医科大学基础医学院赵丽教授课题组博士及科研助理招聘
已经有0人回复
-
特种医学论文润色/翻译怎么收费?
已经有93人回复
» 抢金币啦！回帖就可以得到:
-
陕西理工大学资源与环境、材料化工部分调剂名额，理工兼收
+1/186
-
中科院三区，审稿速度快，期刊Journal of Groundwater Science and Engineering
+1/84
-
求助有机化学第二版陆阳申东升主编课件或者电子版书籍
+1/82
-
焊接专业应届毕业生招聘
+1/81
-
大连工业大学 高分子材料 接收考研调剂
+1/41
-
艾里卡特 (Alicat) - 燃料电池测试系统与质量流量和压力仪表
+3/28
-
考研调剂招生
+1/26
-
武汉纺织大学全重硕士调剂
+1/23
-
浙江大学光电学院、极端光学实验室 阿秒方向 招聘科研助理2名
+1/12
-
南京林业大学化工院有机合成方向硕士招调剂
+1/11
-
西安工程大学环境与化学工程学院能源环境催化与先进材料课题组招生
+1/9
-
☆ ☆ 中山大学附属第七医院肖芷洁课题组诚招分子医学方向硕士生（调剂生） ☆ ☆
+1/5
-
中国地震局地质研究所+地球物理专业+接收调剂
+1/4
-
Top-88悉尼科技大学数据科学/AI 招收2027年入学 校奖 博士生1到2名(国际和本地学生）
+1/4
-
CD40L抗体如何调控免疫应答？
+1/3
-
招聘硕博生：基于机器学习和人工智能的结构/合金设计-西安交大
+1/2
-
英国剑桥好房出租
+1/1
-
2026年 武汉纺织大学 技术研究院 纺织纤维及制品教育部重点实验室 接收调剂研究生！
+1/1
-
26博士申请
+1/1
-
西交利物浦大学（苏州）/刘雯老师课题组/招博士研究生
+1/1
简单回复
庚辰辛丑2楼
2024-05-11 19:55
回复
科研虫子小助手(金币+1): 谢谢参与
nono20093楼
2024-05-12 09:05
回复
科研虫子小助手(金币+1): 谢谢参与
`
2024-05-12 21:38
回复
科研虫子小助手(金币+1): 谢谢参与
wwjdwwjd5楼
2024-05-13 00:17
回复
科研虫子小助手(金币+1): 谢谢参与
tzynew6楼
2024-05-13 10:09
回复
科研虫子小助手(金币+1): 谢谢参与
