| 查看: 9039 | 回复: 7 | |||
| 【有奖交流】积极回复本帖子，参与交流，就有机会分得作者 科研虫子小助手 的 1 个金币 ，回帖就立即获得 1 个金币，每人有 1 次机会 | |||
[交流]
蛋白实验 | 免疫共沉淀
|
|||
|
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是一种利用抗原与抗体之间的专一性为基础，广泛应用于研究蛋白质与蛋白质相互作用的经典研究方法。 原理 如果细胞内两蛋白（A、B）有直接或间接的相互作用时，那么在温和的裂解条件下获得的蛋白样品中加入 A 蛋白的抗体将A蛋白沉淀下来，在细胞内与A蛋白直接相互作用的B蛋白或与其间接相互作用的C蛋白能一起被沉淀下来。使用western blot检测沉淀中是否存在B或C蛋白来确定B或C蛋白与A蛋白的相互作用。 用途 1、检测A、B蛋白在体内是否相互结合 2、分离与A蛋白相互作用的蛋白复合物 优缺点 优点： （1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态； （2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响； （3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。 缺点： （1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用； （2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用； （3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。 步骤 一 细胞的铺板与转染 1、提前一晚将293T细胞铺板至6 cm皿中，铺板量以达到相应的转染试剂要求为准； 2、用各实验室相应的转染试剂将以下质粒组合转染两皿细胞：flag 空载+HA-B；flag-A+HA-B；每质粒2微克。 二 免疫沉淀 1、转染24小时后，收获细胞，每皿加入500 μL裂解液，收集细胞至1.5 mL EP 管中，在冰上超声破碎细胞； 2、超声好后，4℃，12,000 g，离心30分钟，取400 μL上清液用于免疫沉淀，80 μL上清用作总蛋白并加入等体积的2Ⅹ loading buffer； 3、将400 μL上清加入用裂解液清洗了3遍的beads中，加入0.3-0.5 μg flag抗体，4℃孵育 3-4 小时； 4、4℃，2,000 rpm，离心3分钟，去除未结合的液体，留下beads沉淀，用预冷的蛋白裂解液清洗沉淀3次，每次5分钟； 4、最后一次去除清洗液，往沉淀中加入60 μL 2Ⅹ loading buffer，和总蛋白一起在沸水中煮沸 15 分钟。 三 Western Blot 检测 通过 SDS-PAGE 分离样品，利用全蛋白样品作为对照，检测flag-A和HA-B蛋白是否发生结合。 注意事项 1、对于内源的Co-IP检测应该用10cm皿来培养目的细胞，并维持较好的生长状态； 2、如果该实验用于新蛋白的鉴定，应注意抗体重链和轻链的影响； 3、该实验不能确定蛋白之间的相互作用是直接还是间接的。 |
回复此楼» 猜你喜欢
2020或2021年国家执业药师考试指南 西药四科
已经有6人回复
-
求问中国康复理论与实践杂志的投稿流程
已经有3人回复
-
特种医学论文润色/翻译怎么收费?
已经有216人回复
-
投的综述退修了，意见看不太懂
已经有7人回复
-
35岁已过，直接申请面上项目，立个Flag
已经有27人回复
-
关于医学传统综述投稿的问题
已经有2人回复
-
Hindawi为什么还不和我要版面费？
已经有13人回复
-
西医考研306 总分286 不挑专业 求导收留 全日制专升本
已经有1人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 抢金币啦！回帖就可以得到:
-
告别流水线爽文！108万字完结仙侠《女娲石之灵石奇缘（仙界篇）》值得细品
+1/4054
-
散金祈福
+3/870
-
五大联赛看好哪支球队
+5/250
-
散金求好运
+1/200
-
上海交通大学张航课题组招聘博士后（电化学储能）
+1/92
-
山东征女友，坐标济南
+1/91
-
Polymers 期刊特刊 组稿
+1/85
-
哈尔滨工业大学（校本部）电子与信息工程学院2027级博士招生
+1/68
-
上海交通大学张航课题组招聘博士后（电化学能量存储与转换）
+1/47
-
武汉，诚征男友，不异地，年龄大了
+1/36
-
上海交通大学化学化工学院倪伟焱课题组招收2027年申请考核制博士生（电催化+高分子）
+1/28
-
坐标北京诚征男友
+1/17
-
2027环境工程博士申请
+1/9
-
找女友
+1/7
-
中国科学院生态环境研究中心环境工程相关方向招收保送硕士和联合培养博士和硕士研究生
+1/4
-
新审查指南施行半年，AI方向的专利申请是不是更看"技术味"了？
+1/4
-
南京医科大学-冯璋课题组-招收2027级生化与分子生物学专业博士和硕士研究生
+1/3
-
骨组织空间组学样本前处理关键要点：脱钙工艺对空间多组学数据质量的影响
+1/2
-
出全新蔡司 Plan?APOCHROMAT 20×/0.8 平场复消色差物镜
+1/2
-
北理工集成电路杰青团队 | 诚招科助理
+1/2
简单回复
2024-05-09 14:06
回复
2024-05-09 14:11
回复
nono20094楼
2024-05-09 16:03
回复
科研虫子小助手(金币+1): 谢谢参与
·
tzynew5楼
2024-05-09 23:47
回复
科研虫子小助手(金币+1): 谢谢参与
wwjdwwjd6楼
2024-05-10 00:13
回复
科研虫子小助手(金币+1): 谢谢参与
庚辰辛丑7楼
2024-05-11 19:45
回复
科研虫子小助手(金币+1): 谢谢参与
三千里悟道8楼
2024-05-14 10:56
回复
