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AFLP选择性扩增条带弥散
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最近做的AFLP选择性扩增条带弥散成一片 大概在300-800之间 根本看不出比较亮的一条一条的带 用的是1%的琼脂糖胶 请问弥散的原因是什么？ 酶切、连接体系 10×Buffer 5ul 接头 各1ul（5mM） Primers 各0.2ul（100ng/ul） 模板 1.2ul T4连接酶 5U 10mMATP 5ul EcoR I 5U MspI/HpaII 5U 加ddH2O 至50ul 预扩体系 10×Buffer 2ul dNTP 0.4ul Primers 各0.2ul（100ng/ul） 模板 1.2ul rTap酶 0.2ul 加ddH2O 至20ul 另外PCR条件是这样的 1.94℃变性 30s 2.60℃（59）退火 40s 3.72℃延伸 1 min 4.72℃延伸 10 min Step1 to step3循环37次 6.4℃ for ever 选扩体系是这样的(预扩增产物直接使用 未稀释) 10×Buffer 2ul dNTP 0.4ul Primers 各0.5ul（100ng/ul） 模板 3ul rTap酶 0.2ul 加ddH2O 至20ul 另外PCR条件是这样的 1.95℃预变性 3min 2.94℃变性 30s 3.65℃退火 30s 4.72℃延伸 1min 5.step2 to 4 12个循环 6.94℃变性 30s 7.56℃退火 30s 8.72℃延伸 1min Step6 to 8循环23次 9.72℃延伸 10 min 6.4℃ for ever [ Last edited by amisking on 2009-10-23 at 12:56 ] |
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