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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » AFLP选择性扩增条带弥散
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董文娟

金虫 (小有名气)

[交流] AFLP选择性扩增条带弥散

最近做的AFLP选择性扩增条带弥散成一片 大概在300-800之间 根本看不出比较亮的一条一条的带 用的是1%的琼脂糖胶  请问弥散的原因是什么？
酶切、连接体系
10×Buffer   5ul
接头       各1ul（5mM）
Primers        各0.2ul（100ng/ul）
模板         1.2ul
T4连接酶      5U
10mMATP         5ul
EcoR I              5U
MspI/HpaII        5U
加ddH2O     至50ul

预扩体系
10×Buffer   2ul
dNTP           0.4ul
Primers        各0.2ul（100ng/ul）
模板         1.2ul
rTap酶      0.2ul
加ddH2O     至20ul
另外PCR条件是这样的

1.94℃变性            30s
2.60℃（59）退火     40s
3.72℃延伸            1 min
4.72℃延伸            10 min
Step1 to step3循环37次
6.4℃ for ever
选扩体系是这样的(预扩增产物直接使用 未稀释)
10×Buffer   2ul
dNTP           0.4ul
Primers        各0.5ul（100ng/ul）
模板         3ul
rTap酶      0.2ul
加ddH2O    至20ul
另外PCR条件是这样的
1.95℃预变性          3min
2.94℃变性            30s
3.65℃退火     30s
4.72℃延伸            1min
5.step2 to 4 12个循环
6.94℃变性            30s
7.56℃退火     30s
8.72℃延伸            1min

Step6 to 8循环23次
9.72℃延伸            10 min
6.4℃ for ever

[ Last edited by amisking on 2009-10-23 at 12:56 ]
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1楼 2009-10-23 09:50:01
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mhb828

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+3,VIP+0): 10-23 12:56
原因可能很多，给你点建议：
换引物组合：
电泳缓冲液和胶用心的；
PCR产物降解：
凝胶的浓度最好大一点，如2%。
另外你的选择性扩增怎么没有从温度65逐步降到56，就是前12循环每个退火温度降0.7度

[ Last edited by mhb828 on 2009-10-23 at 12:21 ]
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2楼2009-10-23 12:14:26
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董文娟

金虫 (小有名气)
另外你的选择性扩增怎么没有从温度65逐步降到56，就是前12循环每个退火温度降0.7度 这个是必须的么？
之前没有降也扩出了条带
电泳图很漂亮
赞一下 回复此楼
3楼2009-10-25 14:04:14
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董文娟

金虫 (小有名气)
这两天重新做了酶切连接  今天选扩检测仍是没有条带 弥散一片 MARKER跑得很好（预扩在300-800之间）而且条带基本都很大 从点样孔就开始弥散 大部分都大于1000
什么原因啊
赞一下 回复此楼
4楼2009-10-25 14:12:06
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