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00xiaoma金虫 (正式写手)
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请问有会检测细菌内毒素的虫友吗？急需帮助！！ 已有4人参与
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我想知道检测细菌内毒素都需要什么仪器和药品，先谢谢啦，嘿嘿 [ Last edited by 00xiaoma on 2009-10-23 at 12:44 ] |
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2楼2009-10-23 09:59:16
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鲎试验检查细菌内毒素应注意的问题
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方法：通过对干扰鲎试验准确性干扰因素的分析(包括鲎试剂本身、操作条件、配制原料等)，提出了鲎试验中应注意的问题。结果：只要克服了检查中的干扰因素，鲎法具有比家兔法更简便、快速、灵敏度高、重现性好等优点。 鲎试验是利用鲎的变形细胞与微量内毒素产生凝集反应的现象，作为判断供试品中细菌内毒素限量是否符合规定的一种方法[1]。它具有比家兔法更简便、快速、灵敏度高、重现性好等优点。中国药典1995年版已收载细菌内毒素检查法(简称鲎试验)，但只用于几种输液的检查。根据现有的实验证明，凡不干扰细菌内毒素检查或虽有干扰，但可以克服的药品注射剂，将能够全部以鲎法代替家兔热原检查法。但是该法受到许多因素的影响，故在做鲎试验检查时，应注意下列问题。 1鲎试剂本身 1.1鲎试剂灵敏度为了保证检查细菌内毒素结果的准确性，用于试验的鲎试剂应首先核对灵敏度。因为在我们的实际工作中，发现鲎试剂均符合药典规定标准前提下，由于生产厂家不同，部分鲎试剂的实测灵敏度与标示值有差异而导致检测同一检品时，用相同标示值的鲎试剂，出现不同结果。因而先核对灵敏度可避免因鲎试剂本身造成的判断失误。建议法定部门和生产单位应注意鲎试剂的质量检查。 1.2供试品稀释在取样品时，一定要熟悉中国药典的内容，不能直接取大输液原液0.1ml进行检查，这是排除干扰因素的简单有效的方法。因药典已明确规定试验中鲎试剂的灵敏度不超过0.5EU/ml，根据供试品的稀释公式：供试品稀释倍数=L/λυL：供试品的内毒素限量(1EU/ml)λυ：鲎试剂灵敏度的标示值(EU/ml)故检测大输液均应稀释后才能进行试验，如选用更高灵敏度的鲎试剂，则应增加样品的稀释倍数。稀释用的细菌内毒素检查用水药典作了规定。在4h内不得与鲎试剂产生凝集反应。 如果直接用供试品原液试验，就会使供试品的内毒素提高到0.5EU/ml或0.5EU/ml以下，这样，根据目前大输液的生产和贮藏条件，有些就会达不到，鲎法检出的阳性率会提高，兔法复核的机遇也将增多，势必会浪费人力物力。 2操作条件 2.1操作熟练程度操作时严格按无菌操作法进行，安瓿开启前应先用砂石划痕(不管是色点或包环易折安瓿)，用手半拉半掰将颈部折断，防止碎玻屑掉入安瓿内及有一个比较整齐的颈口。在鲎试剂的溶解、样品的稀释及加入时，取样均应准确量取。操作时，双手避免在安瓿或试管的上方来回移动，加样后迅速封闭管口，并立即放入恒温水浴箱中，且整个操作过程中时间应紧凑，防止微生物的污染，否则易致假阳性的出现。 2.2混合液的pH值供试液与鲎试剂混合液的pH值对鲎试验的影响较大，根据国内外资料的报道，试验的最适pH为6.25～7.25才能形成最佳凝胶[2]。而药典规定各种葡萄糖注射液的pH为3.2～5.5，我院控制在3.7～42之间。我们曾对pH值小于4.0的多批次葡萄糖注射液作了调pH和不调pH的比较试验，结果发现在该pH范围内两者无显著差异，不调pH者阴性抑制试验仍可得到坚实的凝胶，说明不影响反应灵敏度，且鲎试剂本身具有一定的缓冲能力。但pH值过大或过小均可抑制鲎试剂与细菌内毒素的反应，其原因可能是pH值过大或过小均可破坏极微量的内毒素。 2.3保温温度将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水稀释成1EU/ml，进行鲎试验，然后分别放置于25、28、31、34、37、40、43、46、49℃水浴保温。实验中观察到凝胶形成的速度随着温度的升高而加快，但到达49℃保温90min也未出现凝胶。 从实验可以看出，温度对鲎试剂的灵敏度影响很大，保温温度在25～40℃之间，随着温度的升高，鲎试剂的灵敏度亦增大，在40～46℃之间，温度对鲎试剂的灵敏度无明显影响，达到49℃或更高温度时，则会破坏鲎试剂。故应严格按照药典的要求，温度控制在(37±1)℃之间，才可获得理想的结果。 2.4保温时间将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水稀释成1EU/ml，进行鲎试验，37℃水浴保温，分别在10、20、30、40、50、70min时观察，发现凝胶形成的坚实状态随着时间的延长而坚固。 从上述实验可以看出，延长保温时间，可以提高鲎试剂的灵敏度，增加假阳性。故应遵守我国药典规定的保温(60±2)min时间。 2.5在鲎试验过程中应防止试管受到振动鲎试剂与细菌内毒素形成的凝胶受到振动后易变形而误判为阴性。因此，在鲎试验过程中，不宜进行容易引起试管振动的实验操作，试验用的试管架的眼孔直径应与安瓿或试管直径相接近，避免安瓿或试管左右晃动。水浴箱要放置在固定不易受到振动的地方，保温过程中不可随时取出观察。 3其它 3.1配制的原料在鲎试验检测中，0.9%氯化钠注射液多次出现假阳性反应，对此进行了实验工作，查找原因，发现阳性率高与厂家原料有关。笔者把不同厂家生产的氯化钠原料配制的0.9%氯化钠注射液，对不能通过鲎法检查的送药检所用兔法检查，结果为阴性，其中个别厂家的阳性率高于其它厂家，为此将不同厂家的氯化的原料分别在230℃烘焙1h后进行比较，发现个别产品色泽明显变黄。按中国药典1995年版附录规定的易炭化物检查，分别将不同厂家的氯化钠原料进行易炭化物相对照检查，结果上述明显变黄厂家的氯化钠色泽较深。因此认为个别厂家的注射用氯化钠原料含有较多的有机杂质，希望厂家要控制好质量。另外，在葡萄糖原料中偶有存在着β-D聚葡糖的现象，它与鲎试剂发生凝集反应，但注入兔体内不能使其升温，故造成假阳性，所以最好是使用定点厂家合格的葡萄糖原料。 3.2所用器皿均应彻底洗净和灭菌安全实验用器皿均应充分洗涤并冲洗干净，特别是接触酸碱或用洗衣粉、洗液等洗涤后，更应冲洗干净，以免残留物破坏极微量的内毒素。灭菌应按药典中的有关方法处理，防止引入外源性内毒素。如有条件的话可用合格的细菌内毒素快检盒。 3.3阳性对照我国药典规定鲎试验必须做阳性对照，其目的就是证实实验条件下鲎试剂的活性，所以在实验过程中，阳性对照如为阴性，此次试验无效，应重新复做。另外细菌内毒素工作标准品应现用现稀释，不可放置后再用。 |
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