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我目前按照下面的甘油法做感受态，现做现用，转化两次都不成功，能不能指导下问腿出在哪里？
1,培养基
LBG培养基(g/l):酵母膏5,蛋白胨10,氯化钠10,ph7.0,用于培养谷氨酸棒状
杆菌制备感受态的种子液。
EPO培养基(g/l):酵母膏5,蛋白胨10,氯化钠10,甘氨酸30,Tween80 1ml/l。
用于谷氨酸棒状杆菌感受态的制备。
LBHIS培养基(g/l):酵母膏2.5,蛋白胨5,氯化钠5,脑心浸液18.5,山梨醇91。用于谷氨酸棒状杆菌转化子的培养。
相应的固体培养基中加入2%的琼脂粉。
谷氨酸棒杆菌的培养条件:30°C,200rpm。
2,谷氨酸棒状杆菌感受态的制备:
(1)将一环谷氨酸棒状杆菌的种子接种于种子培养基中,200rpm,30°C过夜培养。
(2)以10%的比例转接于100ml培养基中,使初始细胞OD达到0.3,200rpm30°C
培养3-5h至OD达到0.6-0.9.
(3)将所有菌液放入50ml离心管中冰浴15min,4000rpm,4°C离心10min。
(4)取预冷的10%甘油约30ml,充分悬浮菌体,4000rpm,4°C离心10min
(5)再次取预冷的10%甘油重复洗涤两次。
(6)用400ul预冷的10%甘油重悬细胞,1.5ml离心管分装,每管80ul,-70°C保
存或者点击转化。
3谷氨酸棒状杆菌的电转化法:
(1)将新鲜制备(或者冰箱取出)感受态细胞和连接产物置于冰上，轻弹管壁使其混匀。
(2)吸取5ul 冰上预冷的质粒加入感受态细胞中,轻弹管壁使其匀,然后冰浴5-10min.
(3)加入预冷的0.1cm 电击杯中,1.8kv,5ms电击。加入恢复用培养基LBHISml温46°C水浴6min.
(4)30°C，100rpm 培养 1h.
(5)涂布含有抗生素的平板,30°C过夜培养观察。 |
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