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手把手带你了解真菌性角膜炎
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操作方法 1、真菌菌液的配制 菌液浓度从106～1010 CFU／ml不等，至今没有一个统一的浓度标准。随着菌液浓度的增加‚角膜的感染成功率提高，而一次接种达到106CFU就足以使所有角膜感染真菌。但是一次接种的菌液量很有限（0.005ml～0.1ml），这就需要配制的真菌菌液达到很高的浓度（至少达到107CFU／ml）。 2、角膜接种的方法 （1）角膜基质注射法 使用带28或30号针头的0.5ml胰岛素注射器，将0.05ml预制真菌菌液注入动物角膜中央基质层内，形成一定的容积，注射深度约角膜基质的1／3深度，主要用于真菌性角膜炎药物疗效和诊断方法的研究。为了提高真菌的感染率和维持角膜的持续感染，部分研究在接种真菌之前一天，将实验动物眼球结膜下注射一定量的皮质类固醇激素（如12mg氟羟强的松龙），但是这种动物模型与真菌性角膜炎临床病例自表面感染的自然病程很不相同，皮质类固醇激素可以改变正常的真菌性角膜炎的病程，而且基质内注射在一定程度上破坏了角膜的正常结构，所以不适合用以研究真菌感染角膜的发病机制、发生发展过程及感染组织病理学的研究。 （2）角膜接触镜法 接种真菌前，完整刮除兔角膜中央直径7mm范围的上皮，然后覆盖上软性角膜接触镜，在接触镜与角膜层间注入0.1ml白色念珠菌菌液（浓度1010CFU／ml），再行暂时性睑裂缝合术，24小时后打开睑裂并去除角膜接触镜，此方法近似人角膜感染的病程，即真菌孢子沉着于去除上皮的角膜表面，生长并产生菌丝侵入角膜基质。 缺点：但是经过皮质类固醇激素处理的动物，其角膜感染重，真菌菌丝浸润范围深而广，而且与使用皮质类固醇激素的剂量成正比。虽然文献报道此法建立的动物模型相对模拟临床上人角膜真菌感染的情况，感染成功率较高，可不依赖皮质类固醇激素，现在已经应用于念珠菌性角膜炎的组织病理学研究，但是实验中所应用的真菌菌液浓度很高，达到2×109或1010CFU／ml，这一浓度几乎是基质注射法所采用的数十甚至上百倍，据真菌感染机体发病机制的研究，其发病除与致病菌种、真菌毒力、机体免疫状态有关，还可能与真菌数量有关，过高浓度的真菌菌液是否引起真菌性角膜炎病变过重，其病程是否存在差别，目前尚无明确的研究结果，所以此方法并不完全近似临床真菌感染角膜的实际情况；而且其仅研究了白色念珠菌，对于发展中国家中最常见的镰刀菌属，缺乏相关研究。 （3）角膜表面镜片术法 刮除角膜中央部分上皮（约6mm）后，将预制的全厚异体角膜植片（甘油冷冻保存）缝在动物角膜表面，层间注入一定量的真菌菌液，接种后24小时移去角膜植片。 优缺点：此方法不依赖皮质类固醇激素，所应用的真菌菌液浓度相对较低，角膜植片以缝线固定，其层间空间稳固，保证了真菌成分与创伤角膜表面的充分接触，创造了适合真菌生存繁殖的良好环境，其感染成功率高，近100％，可重复性较好；但是此方法操作过程相对复杂，对实验者的手术技术水平有一定的要求。 感染成功后的鉴定 真菌培养检查是最基本的手段，准确率较高而且较简单，也是真菌鉴定的金标准。对感染组织进行真菌培养，常规鉴定使用的培养基为沙氏葡萄糖琼脂（SDA）斜面培养基，加0.05％氯霉素，经过至少72小时后待培养基表面有真菌菌落生长后观察并鉴定菌种，霉菌常用形态学鉴定，而酵母常以形态和生理结合方法鉴定。 感染角膜取活体组织进行组织病理学检查也是真菌菌种鉴定的重要方法，但不够准确特异，需进一步借助更为特异的方法来鉴定。免疫组织化学方法可通过检测真菌特异性抗原来诊断组织中的真菌病原体，除特异性外，免疫组织化学技术比组织化学方法更为敏感，是仅次于培养法这一金标准的最特异的诊断手段。 感染后角膜病变的观测和量化 目前常用裂隙灯显微镜观察角膜感染灶并行大体及裂隙照相，记录角膜病灶形态、感染范围、深度及前房反应情况进行临床评分，评分标准可参照 O’DAY改进方法。 重点为根据角膜感染灶范围分为0～4共5级；根据角膜病变深度分为0～4共5级；根据前房反应程度分为0～4共5级；依据以上三个标准对每一眼进行临床评分，综合三个分数为该眼总分，将角膜感染量化。 总结 医学科学的严谨性要求在真菌性角膜炎的基础研究中，需要建立一种成功率高、病程的发生发展模拟人角膜感染的过程、统一采用的动物模型制作方法，保证动物实验研究的成果客观、可信、可重复，服务于临床对真菌性角膜炎的防治，降低此种疾病的致盲率，从而推动眼科感染性角膜病科学研究的进步，这需要广大医学工作者不懈努力，不断尝试摸索实现这一目标。 |
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