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科研顾问_Gu新虫 (小有名气)
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干货分享 | 你的生物实验室的缓冲液，是这些吗？
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实验室中常常使用的各类溶液种类繁多，且配制方法五花八门，是否挑花眼了呢?本文总结了近三十种常用溶液、缓冲液、培养基的配制方法，涵盖了分子生物学、蛋白分析、细胞培养、微生物培养等各个领域。 核酸电泳之 TBE、TAE 和 MOPS 缓冲液 三羟甲基氨基甲烷(Tris)是一种应用非常广泛的有机试剂。它及其衍生物被广泛应用于生物化学和分子生物学实验中的缓冲液的制备，可用于制作药物、有机合成、生物缓冲剂等。 用途：可以用于进行试剂的配制、蛋白质电泳、抗原和抗体稀释等。优点：1)溶解性：Tris能够很好地溶解在水中，便于制备不同浓度的缓冲液;2)稳定性：Tris-HCl缓冲液在储存和使用过程中稳定性较好;3)缓冲范围：Tris-HCl缓冲液的缓冲范围在中性偏碱，适合保护含酶的试剂组分;4)低毒性：Tris是一种低毒性的化学品，适合用于生物实验。缺点：1)温度效应大：温度变化对缓冲液pH值的影响较大;2)潜在的离子干扰：Tris-HCl缓冲液中的氯离子可能会在某些实验中引起干扰;3)成本：相比于PBS等缓冲液，Tris可能成本较高。 Tris盐酸缓冲液中加入EDTA制成“TE缓冲液”，TE缓冲液是弱碱性，对DNA的碱基有保护性，因此，DNA在TE中的稳定性较好，不易被破坏完整性或产生开环及断裂，TE缓冲液被用于DNA的稳定和储存。 将调节pH值的酸溶液换成乙酸，则获得“TAE缓冲液”(Tris/Acetate/EDTA)，将调节pH值的酸溶液换成硼酸，则获得“TBE缓冲液”(Tris/Borate/EDTA)。TAE与TBE是使用最广泛的缓冲系统。 MOPS是一种有机磺酸类化合物，由3-(N-吗啉)丙磺酸(MOPS)配制而成, 使用浓度为0.01M-0.05M，常用的缓冲范围在pH 6.5-7.9，最佳缓冲区间大约在pH 6.8-7.4，MOPS具有良好的水溶性和稳定性。在RNA电泳中，MOPS缓冲剂主要通过其离子化作用来维持电泳过程中的pH稳定，从而防止RNA的降解和变性。此外，MOPS还具有较低的离子强度，可以减少RNA分子之间的相互作用，提高分离效果。 TBE、TAE、MOPS作为实验室储备溶液中最常见的几种缓冲液，其缓冲能力与应用场景却有一些区别。TAE 的缓冲能力弱于 TBE，并且 TBE 跑胶分辨率高于 TAE。在应用时，TBE 常用于小分子 DNA 片段电泳分析，TAE 适用于大分子 DNA 片段电泳分析及后续酶促实验，MOPS 则适用于更多RNA 电泳分析。 蛋白电泳缓冲液种类非常之多，需要根据凝胶体系来进行选择。凝胶系统为 Tris-甘氨酸体系时，可选择 Tris-甘氨酸电泳缓冲液，凝胶系统为 Bis-Tris 体系时，可选择 MES 或 MOPS 缓冲液，当凝胶系统为 Tris-tricine 体系时，则选择 Tricine 缓冲液。 并且，蛋白电泳缓冲液分为变性与非变性缓冲液，区别在于变性缓冲液需加入 SDS 中和电荷。我们通常研究 WB、IP 时，使用变性缓冲液研究分子量大小即可，非变性缓冲液常用于研究蛋白空间结构、等电点等。 上样缓冲液(Loading Buffer)是各类实验不可缺少的，可根据实验类型选择不同的 Buffer，以下展示 DNA 电泳 Loading Buffer、RNA 电泳 Loading Buffer 以及 SDS-PAGE Loading Buffer 的配制方法。 分子杂交包含了核酸杂交和蛋白杂交，在实验过程中，各类常用溶液也是必不可少的一环。使用膜杂交法时，可选择 Denhardt's 溶液，核酸杂交中变性和清洗，可选择 SSC 溶液、 DNA 变性缓冲液。 蛋白分析的过程，少不了转膜液、清洗液的参与。WB 转膜液用于将印迹从凝胶转印至膜上，TBST 缓冲液可以用于 WB、IF、IHC 等实验中封闭液、一抗或二抗配制以及抗体孵育后的洗涤，WB 封闭液则可用于减少非特异性抗体结合。TBST缓冲液TBST中含有Tris-HCl，NaCl，tween20这三种物质，是做Western Blotting中常用的一种洗膜缓冲液。目的是洗掉非特异性吸附的蛋白质，并且维持一个接近的天然环境。 平衡盐溶液是细胞培养过程中的常见溶液。在选择平衡盐溶液时，PBS 主要用于胚胎、组织、细胞的漂洗、冻存和培养，而 HBSS 除了 PBS 的用途外，还可以用于细胞培养试剂的配制、细胞计数的稀释，EBSS 缓冲能力最强，是专为 CO2 环境中的细胞短期维持而设计。 磷酸盐缓冲液(PBS)：由磷酸氢二钠和磷酸二氢钠按照不同比例配制而成。常用的缓冲范围在pH5.8-8.0，使用浓度为0.1-0.2M。用途：可以用于样本稀释、试剂的配制、洗涤液配制等。优点：1)生物相容性：PBS对蛋白质类生物大分子相对温和，不会引起变性或损伤;2)稳定性：PBS在储存和使用过程中稳定性好，不易受外界环境影响;3)离子强度：PBS提供了适当的离子强度，有助于维持生物分子的结构稳定;4)无毒性：PBS成分简单，无毒性，适合用于生物样本和试剂的处理。缺点：1)潜在的微生物污染：PBS如果不添加防腐剂，容易受到微生物的污染;2)缓冲能力限制：在极端pH变化的情况下，PBS的缓冲能力有限，可能不足以维持稳定的pH值;3)易与常见的钙镁离子及金属离子缔合成沉淀。 在微生物培养中，LB 培养基当属最常见的，另外还有 Ampicillin 可用于筛选抗性菌，IPTG 一般用于蓝白斑筛选，而 X-Gal 作为 β-半乳糖苷酶的显色底物，常用于 β-半乳糖苷酶原位染色检测及蓝白斑筛选。 (Buffer Solution) 通常指的是由弱酸及其盐、弱碱及其盐组成的混合溶液，作为分析化学当中的重要概念，缓冲液的 pH 值在一定的范围内可以保持稳定，不因稀释或加入少量酸碱而发生 pH 的改变，可以广泛应用于各类实验中。 缓冲溶液的选择需要根据实验所需维持的 pH 范围来选择合适的缓冲液。缓冲液作为弱酸、弱碱及其盐的混合液，要使其具备足够的缓冲能力，最重要的是使缓冲液中弱酸的 pKa 等于或接近于实验所要求的 pH 值，缓冲液中弱酸的 pKa 是选择缓冲溶液的主要依据。 |
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