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小鸡腿a

新虫 (初入文坛)

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[求助] 基因敲除实验求助已有1人参与

基因敲除实验求助，本人正在做假单胞菌株基因的敲除，利用同源重组的原理构建了上下游同源臂，载体为自杀质粒含SacB基因对蔗糖敏感，已重新构建目的基因上下游至自杀质粒中，利用接合转移或是电转方法在双抗板上筛选出野生菌携带重组质粒。
目的基因是耐药基因，野生菌株是假单胞菌（含有4ug/ml美罗抗性，在10ug/ml四环素也能长，超过20ug/ml四环素不长），使用的自杀质粒是含有SacB基因的pEX18Tc（含有四环素抗性），在单交换这一步尝试过接合转移，也尝试过电转，有时能在双抗板上长出单克隆，有时不能；有一次电转后将双抗板（20ug/ml四环素+4ug/ml美罗）上的出现单克隆进行之字划线后做PCR，概率是120个中出现了2个SacB阳性条带和野生株特异基因条带，将阳性的之字划线再去密涂保种方便后续用蔗糖平板筛选出双交换，但是将密涂保种的菌进行PCR时，SacB阳性条带已经消失了，再去取之字上的菌做PCR时，SacB基因阳性条带也消失了，求助各位大神想知道这是什么原因，为什么出现条带后又消失了，如果正确的话我应该如何将阳性条带进行保种，好不容易出现一次SacB阳性，已经很久没做出这个实验了，我应该如何得到单交换菌株？？求助各位大佬们有空时解答！！！
还有一个问题得到单交换菌株后，用无抗性液体培养后稀释1000倍再涂布蔗糖平板，再利用原始野生株包含目的基因上下游片段进行PCR，若敲除成功，则扩增条带将缺少目的基因对应的长度。尝试在10%的蔗糖和15%蔗糖平板上涂布了，37℃温箱培养了18h，再挑取很多个单克隆做的PCR，还是没结果，是否蔗糖平板在37℃温箱培养时间要延长？？求助各位大佬们有空时解答！！！

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