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chengtao9688木虫 (小有名气)
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[交流]
关于细菌膜蛋白的提取
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请问有哪位大侠做过细菌膜蛋白的提取？ [ Last edited by amisking on 2009-10-20 at 12:29 ] |
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2楼2009-10-20 08:52:33
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3楼2009-10-20 10:45:48
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一、从新鲜样品中提取总蛋白（简易法） 1、自配裂解液（pH 8.5-9.0）：50 mM Tris-HCl，2 mM EDTA, 100 mM NaCl，0.5% Triton X-100，调pH值至8.5-9.0备用；用前加入100 μg/ml 溶菌酶，1μl/ml 的蛋白酶抑制剂PMSF。该裂解液用量为10-50ml 裂解液/1g湿菌体。 2、将40ml 菌液在12000g，4℃下离心15分钟收集菌体，沉淀用PBS悬浮洗涤2遍，沉淀加入1ml裂解液悬浮菌体。 3、超声粉碎，采用300w，10s超声/10s间隔，超声20min，反复冻融超声3次至菌液变清或者变色。 4、1000g离心去掉大碎片，上清可直接变性后PAGE电泳检测，或者用1% SDS溶液透析后冻存。 缺点：Western blotting结果表明，疏水性跨膜蛋白提取效率有限。 二、从Trizol裂解液中分离总蛋白 1、Trizol溶解的样品研磨破碎后，加氯仿分层，2-8℃下10000g离心15min，上层水相用于RNA提取，体积约为总体积的60%。 2、用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用1ml Trizol加入0.3ml无水乙醇混匀，室温放置3min，2-8℃不超过2000g离心5min。 3、将上清移至新的EP管中，用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1ml Trizol加入1.5ml异丙醇，室温放置10min，2-8℃下12000g离心10min，弃上清。 4、用含有0.3M 盐酸胍的95%乙醇洗涤。每1ml Trizol加入2ml洗液，室温放置20min， 2-8℃下7500g离心5min，弃上清，重复洗涤2次。最后加入2ml无水乙醇，涡旋后室温放置20min，2-8℃下7500g离心5min，弃上清。 5、冷冻干燥5-10min，1%SDS溶液溶解，反复吹打，50℃温浴使其完全溶解，2-8℃下10000g离心10min去除不溶物。 6、替代方案：将3中的酚醇上清液移至小分子量透析袋中，在2-8℃的1% SDS溶液中透析3次，1000g离心10min去除沉淀，上清可直接用于蛋白实验。 三、从新鲜样品中提取疏水性膜蛋白（Triton X-114去污剂法） 1、配制疏水性蛋白提取液（非裂解液）：1% Triton X-114，150mM NaCl, 10mM Tris-HCl，1mM EDTA，调pH值至8.0备用。 2、菌液于4℃条件下15000g离心15min收集菌体；用1ml 含有5mM MgCl2 的PBS洗涤3次，最后于4℃条件下15000g离心15min收集菌体。 3、菌体沉淀加入1ml冷提取液，于4℃条件下放置2h，17000g离心10min，去除沉淀取上清。 4、将上述上清中的Triton X-114含量增加到2%，再加入20mM的CaCl2抑制部分蛋白酶活性，37℃条件下放置10min使其分层。室温下1000g离心10min使液相和去污相充分分层。 5、将液相和去污相分开，分别用10倍体积的冷丙酮在冰上沉淀45min。 6、于4℃条件下17000g离心30min，用去离子水洗涤沉淀3次。 7、将沉淀溶解在1% SDS溶液中，测定蛋白浓度，比较液相和去污相中蛋白提取效率，一般是去污相中疏水性膜蛋白较多，适于进一步蛋白实验。 8、SDS-PAGE进一步分析液相和去污相的蛋白图谱。 我们以前就是照这个来的 你看看能不能用 |
4楼2009-10-20 11:58:37
chengtao9688
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分离细菌膜蛋白的方法: ① 于20ml 营养肉汤中过夜培养细菌，37℃，200rpm。 ② 10000g、20min、4℃离心，去上清。 ③ 20ml预冷的Tris-Mg缓冲液重悬，同样条件离心，再重悬于预冷的Tris-Mg缓冲液。 ④ 超声波破碎细菌。 ⑤ 3000g，10min、室温下离心去除未破碎细菌。小心吸取上清（含有胞质成分和细菌外被成分）。 ⑥ 超速离心I：100,000g，60min，4℃，去除上清（胞质成分），收集细菌外被成分。 ⑦ 用10ml含2％的SLS的Tris-Mg 缓冲液重悬沉淀物，室温温育20-30min。 ⑧ 超速离心II：70,000g，60min，室温沉淀收集外膜蛋白，去除上清（含细胞质膜）。重复⑦、⑧两步。 ⑨ 充分吸除上清，并根据沉淀体积大小用0.1-0.2 ml的ddH2O重悬沉淀物。根据公式：蛋白浓度(mg/ml)=1.450 D280-0.740 D260测定外膜蛋白浓度，调节蛋白浓度至40ug/ul，该蛋白质样品-70℃贮存。 试剂 ① Tris-Mg 缓冲液 10mM Tris-Cl 5mM MgCl2 pH 7.3，4℃保存 ② 2%(w/v)十二烷基肌氨酸钠 (SLS) 我们用上面的方法做过，但是在8步以后会形成大量的沉淀，如何溶解沉淀问题？如果加大水量溶解必然会使其浓度降低，跑PAGE时蛋白浓度低，效果较差。请问如何解决此问题？ |
5楼2009-10-20 19:54:48
jiaminl
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6楼2009-10-21 16:50:53
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7楼2009-12-06 16:02:33
