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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 质粒提取的问题
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铁虫 (初入文坛)

[交流] 质粒提取的问题

我的载体大小是10.55kb,连接上1500Bp的外源片段后，在Kan的LB平板上挑单菌落摇菌后怎么也提不出质粒，我是用试剂盒提的，是提的有问题还是根本就没有质粒，各位大人帮帮忙，先谢过了！
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1楼 2009-10-18 21:09:59
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
amisking(金币+3,VIP+0): 10-18 22:30
message(金币+1,VIP+0): 10-20 08:55
这个质粒都拷贝数怎么样？我觉得最有可能的就是试剂盒用的有问题，看看溶菌酶、RNA酶什么都都加了没，还有有都Buffer中是需要加乙醇的，看看加了没？如果不行就手抽次看看，如果手抽能抽出来，就说明试剂盒用的有问题，或者试剂盒本身有问题。还有一点就是菌可能有问题，但是因为使用抗性筛选的，所以菌有错误都概率较小。
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2楼2009-10-18 21:46:22
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yangjunzhong

金虫 (小有名气)
★
message(金币+1,VIP+0): 10-20 08:55
可能是没有质粒，可能是假阳性，建议重新连接一次。
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3楼2009-10-18 22:02:57
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humants

金虫 (正式写手)
★
message(金币+1,VIP+0): 10-20 08:55
别先提质粒，做个菌落（液）PCR鉴别一下是了再提取，再用酶切鉴定，这样省时间，成功率高
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4楼2009-10-19 08:41:36
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dudujing

铜虫 (正式写手)
★
message(金币+1,VIP+0): 10-20 08:56
你的在提取质粒前，应该先确定以下工作是否准备好：1、RNase A是否全部加入Buffer S1中。2、Tip头，离心管是否被核酸酶所污染。3、Buffer w2中在是否加入了等体积的无水乙醇
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5楼2009-10-19 09:39:24
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missu

金虫 (小有名气)
同意4楼的说法，先鉴定一下是不是转进去了，大小对不对之类的
如果试剂盒使用正确的话，一般是不会有问题的
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6楼2009-10-19 12:23:11
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bioxixi

木虫 (著名写手)
可能是提的问题吧
如果是假阳性，那扩大培养的时候有kna也会杀死了
这么大的质粒扩增可定比其它小的困难，也容易丢失吧 培养时间再长一点
再就是看看提前过程中有没有试剂或操作不当的地方
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7楼2009-10-19 13:41:54
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lamda

木虫 (著名写手)

笨鸟先飞
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我在提取质粒时碰到过类似的现象。可能的原因会是质粒DNA太大，可能是低拷贝的质粒。所以解决问题的关键是多培养一点菌液，再用试剂盒提取质粒。
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低调
8楼2009-10-23 10:32:56
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guangming111

银虫 (小有名气)
可能的原因会是质粒DNA太大，可能是低拷贝的质粒
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9楼2010-01-10 15:35:20
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