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agloom

铜虫 (小有名气)

[交流] 构建载体的问题!请教各位!

我要构建三个表达载体,载体用的是PKYLX71,分别连三个DNA片段(PCR扩增出来的)。用HindIII和XhoI双酶切后连接,最大和最小的片段都连上了,但是600多K的那个一直连不上,载体应该没问题,同样的反应体系另两个就连上了。引物的酶切位点我没设计错,请问还有什么原因会导致我连不上呢?有什么解决方法吗?谢谢!
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seahow

木虫 (著名写手)


agloom(金币+1):谢谢参与
按照常规 你的链接没有问题。 (应该是600bp吧不是K吧),600不是很长,不知道你了另外两个链接效率如何? 如果不高,可能的原因是保护碱基的作用。建议延长。还有感受态的原因。。

good lucky
2楼2009-10-16 10:32:11
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xiangao

金虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
Hind III不适宜做亚克隆,酶切效率的。有时候切不开
3楼2009-10-16 11:38:00
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agloom

铜虫 (小有名气)

另外两个很容易就连上了,效率也不错。就是600多bp的搞不定,都重新酶切连接几次了,但还是没有阳性克隆。头都大了。
4楼2009-10-16 14:46:01
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agloom

铜虫 (小有名气)

HindIII酶切位点的保护碱基3个为CGG,数量是够了,按说保护碱基的种类与酶切没太大关系吧? 我想是不是HindIII酶切位点没切开,下游引物是没问题的,因为用它构建另一载体成功了。
5楼2009-10-16 14:49:43
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
另外两个都连上了的话,说明体系及酶都是没有问题的,可能就是酶切的问题。用的是什么酶?
6楼2009-10-17 13:27:00
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gandalf886

银虫 (小有名气)

先连t载体去
7楼2009-10-17 13:28:49
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agloom

铜虫 (小有名气)

用的是takara的酶,我也认为是片段没切好,延长酶切时间也不行!头都大了。
8楼2009-10-20 15:39:06
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paulajjh

木虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
那你的链接温度是多少?链接时间呢?不行降低温度,再延长时间,或许有用。
9楼2009-10-20 16:48:59
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