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PCR定点突变
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本人刚开始做定点突变，有问题想请教一下。我的片段大概800bp，克隆在22b质粒上。现在想在片段上改变一个或者几个碱基。不打算用试剂盒。网上搜了几种方法，比较快的是用高保真酶来做PCR，得到整个质粒后用Dnp I 酶进行消化然后转化至大肠杆菌。 那么我想问，用高保真酶设计引物的时候，是以突变碱基为中心点，两边延伸12-16个碱基（即突变碱基在引物中心），还是以引物5‘端邻接,3’端相反的原则进行设计呢？还有的说突变点位于5‘端第5位，我都要晕了。帮帮忙吧。 另外退火时间一般设多长？说明书上是5s或15s，有人用30s。 这种方法还有什么值得注意的地方么？多谢大家了。 [ Last edited by zzgyb on 2009-12-21 at 20:29 ] |
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