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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 连接体系
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虾须镯

新虫 (小有名气)

[求助] 连接体系

加了20ul的连接体系，第一次转化用了10ul，没连上，剩下10ul还能再次用来转化吗？

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1楼 2023-12-13 12:22:00
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yudaoqian88

至尊木虫 (知名作家)

不良人
觉得没必要重新转化吧，如果成功了，这10微升就够了。建议从头开始，重新扩增目的片段，提高回收浓度，按连接比例配比体系，重新连接和转化。

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特别喜欢家门口开门的瞬间，宝宝那个高兴呀，蹦蹦跳跳，好不热闹！
2楼2023-12-13 12:47:32
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AD_com

金虫 (小有名气)
用过的没连上，剩下的大概率也不会连上。建议稍微调节一下比例测测浓度之类的，要是T4连接酶可以温度低一点时间长一点，比如22度2小时，要是同源重组那就50度40分钟以上，可以改善一下。
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3楼2023-12-14 10:09:48
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虾须镯

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yudaoqian88 at 2023-12-13 12:47:32
觉得没必要重新转化吧，如果成功了，这10微升就够了。建议从头开始，重新扩增目的片段，提高回收浓度，按连接比例配比体系，重新连接和转化。

我的载体浓度是65，两个基因一个浓度是61一个是16，16是不是有些太低了呀，这些浓度合适吗

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4楼2023-12-15 17:24:52
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虾须镯

新虫 (小有名气)
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3楼: Originally posted by AD_com at 2023-12-14 10:09:48
用过的没连上，剩下的大概率也不会连上。建议稍微调节一下比例测测浓度之类的，要是T4连接酶可以温度低一点时间长一点，比如22度2小时，要是同源重组那就50度40分钟以上，可以改善一下。

我的片段死2000，用的同源重组37度半小时，连接的比例用的2:1是不是，载体浓度65，基因一个61一个16，需不需要调整比例呀

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5楼2023-12-15 17:26:47
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AD_com

金虫 (小有名气)
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5楼: Originally posted by 虾须镯 at 2023-12-15 17:26:47
我的片段死2000，用的同源重组37度半小时，连接的比例用的2:1是不是，载体浓度65，基因一个61一个16，需不需要调整比例呀
...

同源重组大部分不都是50摄氏度吗？也许你用的重组酶不一样吧，载体和片段的比例算的是摩尔比，需要根据浓度和大小计算一下，所以你只说浓度不知道大小就不知道你的比例是否合适，一般情况下，比例只是为了提高效率，
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6楼2023-12-16 08:56:25
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虾须镯

新虫 (小有名气)
载体是9kb基因是2kb我用的一直是2:1

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7楼2023-12-16 11:34:02
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虾须镯

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by AD_com at 2023-12-16 08:56:25
同源重组大部分不都是50摄氏度吗？也许你用的重组酶不一样吧，载体和片段的比例算的是摩尔比，需要根据浓度和大小计算一下，所以你只说浓度不知道大小就不知道你的比例是否合适，一般情况下，比例只是为了提高效率 ...

载体是9kb基因是2kb我用的一直是2:1，16的那个我是不是应该重做一下呀

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8楼2023-12-16 11:35:14
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