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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 用CRISPR技术进行基因敲除后消除质粒后基因回补了
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长安某吖

铁虫 (初入文坛)

[求助] 用CRISPR技术进行基因敲除后消除质粒后基因回补了

各位师兄师姐，老师们，我最近在做基因敲除的时候，用的CRISPR技术，使用的是pJOE8999质粒，菌株是苏云金芽孢杆菌，在消除基因的时候，电转进入芽孢杆菌后送了一次测序，测序结果是敲除掉了，然后进行无抗LB转接三次消除质粒后，所有点板的菌株都回补了敲除的那个基因，因为本人也对这个也不太了解，（但是也不懂，还是去别人课题组学习的技术，对方实验室也无法给出答案，说没有遇到过，也尝试过解决这个问题，用T2系统敲除法也试过，但是也是在第二次单交换回补了，那就可能是同源交换发生在同一侧，但是pJOE8999就不是这个原因）有没有师兄师姐或者老师，能解答一下孩子的问题嘛 非常感谢
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衣带渐宽终不悔，为伊消得人憔悴。
1楼2023-09-24 18:33:25
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biosci

捐助贵宾 (职业作家)
就是假阳性，开始就没敲除成功

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2楼2023-09-24 22:31:04
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长安某吖

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by biosci at 2023-09-24 22:31:04
就是假阳性，开始就没敲除成功

测序了也是假阳性嘛

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衣带渐宽终不悔，为伊消得人憔悴。
3楼2023-09-24 23:30:02
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biosci

捐助贵宾 (职业作家)
你那个是扩增的同源臂是吧

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4楼2023-09-25 16:54:23
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长安某吖

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by biosci at 2023-09-25 16:54:23
你那个是扩增的同源臂是吧

是的

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衣带渐宽终不悔，为伊消得人憔悴。
5楼2023-09-26 18:24:20
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燕燕吖吖

新虫 (初入文坛)
您好，能否请教一下您的PJOE这个载体的sgRNA 怎么插入的？第一次做，如果你能帮忙指点一下那就太好啦呜呜，有偿

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6楼2024-01-20 17:29:20
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Lee_95

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 长安某吖 at 2023-09-26 18:24:20
是的
...

扩增同源臂会出现假阳性，可以同源臂两侧设计引物在扩增，看条带大小和测序是否正确。
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7楼2024-02-28 14:36:39
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