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临风7071

木虫 (正式写手)

[交流] 载体酶切验证

在论坛上看到别人的帖子:我将自己拿到的片段插入PBI121载体中,PCR验证时,我的目的条带有,但是酶切验证的时候,没有条带,为什么?
以下是跟帖的:
原因可能有很多。
1.PCR验证的时候有没有做个阴性对照?如果阴性对照也能拉出目的条带,这说明片段可能没插入。
2.片段可能插入了,但是酶切的有问题。如酶,Buffer等,或者在酶切位点的选择上。
请问原因1,阴性对照也能拉出目的条带,这说明片段可能没插入。是什么意思啊?如果阴性对照也能扩出来,那扩出来的是什么东西呢?请高手指教
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yanlili

金虫 (正式写手)


阴性对照出现目的条带是因为你的引物特异性不够好,与载体上的部分可以互补配对,从而可以扩出片段。
我想问一下:
1.你做pcr验证的时候用的是扩目的片段的引物吗?你可以试试用载体的测序引物,同时做阴性对照。如果连上的话,重组载体pcr的片段会比阴性对照扩出来的稍大一下,根据你插入片段的大小可以进行判断是否连上了
2.你的目的片段多大?如果在300bp以下的话,如果你的质粒酶切的浓度不够高,切下的片段本来就很小,电泳以后可能会看不到
2楼2009-10-09 08:31:10
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