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[交流]
原核蛋白表达的整体实验流程和具体实验结果
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一、假设目标蛋白的信息 名称： XXX蛋白 大小： 30 kDa 缓冲液：PBS 浓度： 0.6mg/mL 体积： 6mL （3管分装） 标签: 仅6Xhis 纯度： 90%以上 二、实验过程 1蛋白表达载体的构建 1.1 序列二基因序列密码子优化后合成及构建 Optimized for your reference: CATATGxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxCTCGAG 合成时候带上上下游酶切位点分别是Nde I，Xho I（黄色阴影），并克隆到原核表达载体Pet24a载体。 1.2 DNA测序 将经菌落PCR鉴定为阳性克隆测序，测序工作由华大基因完成（见附件）。 2 构建正确的Pet24a-序列二表达载体在大肠杆菌中的表达 2.1 转化至大肠杆菌BL21(DE3) 常规CaCl2法。 2.2 IPTG诱导融合蛋白的表达 2.2.1 挑取转化平板上的单克隆接种于含50 μg/ml Kan的3 ml LB培养液的试管中，37℃ 220 rpm振摇过夜； 2.2.2 次日按1：100接种于50 μg/ml Kan的30 ml LB培养液中，37℃ 220 rpm振摇至菌体OD600为0.4 (约2h)； 2.2.3 取出1 ml培养物，12000g室温离心2 min，弃上清，用100 μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀； 2.2.4 向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/l，37℃ 220 rpm振摇4 h，诱导序列二蛋白表达； 2.2.5取出1 ml培养物，12000g室温离心2 min，弃上清，用100 μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀，剩余培养物4℃ 4000g离心12 min，弃上清，沉淀置-20℃冻存。 2.3 表达产物分布的确定 2.3.1 将表达菌体重悬于400 μl Ni-IDA Binding-Buffer(20 mM Tris-HCl，5 mM咪唑，0.5 M NaCl，pH8.0)； 2.3.2 重悬液进行超声波破碎(冰浴中进行)：功率100 W，工作4 sec，间歇8 sec，共10 min； 2.3.3 超声破碎液4℃ 12000g离心20 min，取10 μl上清液加入等量的2×上样缓冲液，沉淀用400 μl 1×上样缓冲液重悬后取5 μl，恒压150 V进行12% SDS-PAGE，考马斯亮蓝R250染色显带。 3融合蛋白的纯化 3.1 将1 L诱导表达的培养菌体沉淀用20 ml Ni-IDA Binding-Buffer重悬后，超声破碎(功率200 W，工作4 sec，间歇8 sec，共20 min)，4℃ 12000g离心20 min，取上清； 3.2 利用Biologic LP层析系统，上清液以0.5 ml/min流速上样至Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA -Sepharose CL-6B亲和层析柱； 3.3 用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5 ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线； 3.4 用Ni-IDA Washing-Buffer(20 mM Tris-HCl，30 mM咪唑，0.5 M NaCl，pH8.0)以1 ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线； 3.5 用Ni-IDA Elution-Buffer(20 mM Tris-HCl，250 mM咪唑，0.5 M NaCl，pH8.0)以1 ml/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液； 3.6 进行12% SDS-PAGE分析。 三、实验结果 SDS-PAGE结合考染鉴定纯化的XXX蛋白 1-4泳道分别指XXX蛋白放大表达后的全菌、破碎上清、纯化时20mM咪唑洗脱液以及250mM咪唑洗脱液。 |
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