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aaabndj

新虫 (初入文坛)

[交流] 大肠杆菌转化 有菌 一直无阳性? 已有3人参与

大肠杆菌转化 有菌 无阳性

之前构过的一个载体,我做了三次,都没构出来

平末端 直接重组的 流程就是扩基因,切载体,重组 ,没用T4连接酶,最后板子上长了菌,但是菌检一个阳性都没有

做了三次了都做不出来,师姐让我下次用T4连接,到底是哪一步出错了啊

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黄黑波波

新虫 (小有名气)


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第一,扩基因用的酶扩增出的片段是平末端吗,有的酶扩增结束会在3‘加A;第二,平末端连接也应该使用T4连接酶才能连上吧,沒有磷酸二酯键形成不了质粒,线性片段转进菌裡很快就被降解了

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3楼2023-08-07 15:36:16
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咸花生

木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
这种情况肯定是先检查质粒了,切开看看是不是正常

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2楼2023-08-07 08:25:57
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aaabndj

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 黄黑波波 at 2023-08-07 15:36:16
第一,扩基因用的酶扩增出的片段是平末端吗,有的酶扩增结束会在3‘加A;第二,平末端连接也应该使用T4连接酶才能连上吧,沒有磷酸二酯键形成不了质粒,线性片段转进菌裡很快就被降解了
...

这次用T4重做了,菌检有阳性,但是挑菌摇菌,第二天提质粒酶切验证的时候,又切不开

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4楼2023-08-13 14:04:32
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shuaibia6

金虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
好好核对一下载体和目的片段序列,序列不对你做一万次也没用
5楼2023-08-14 14:54:51
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