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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 大肠杆菌转化 有菌 一直无阳性？
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aaabndj

新虫 (初入文坛)

[交流] 大肠杆菌转化 有菌 一直无阳性？ 已有3人参与

大肠杆菌转化 有菌 无阳性

之前构过的一个载体，我做了三次，都没构出来

平末端 直接重组的 流程就是扩基因，切载体，重组 ，没用T4连接酶，最后板子上长了菌，但是菌检一个阳性都没有

做了三次了都做不出来，师姐让我下次用T4连接，到底是哪一步出错了啊

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1楼 2023-08-06 10:25:27
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黄黑波波

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
第一，扩基因用的酶扩增出的片段是平末端吗，有的酶扩增结束会在3‘加A;第二，平末端连接也应该使用T4连接酶才能连上吧，沒有磷酸二酯键形成不了质粒，线性片段转进菌裡很快就被降解了

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3楼2023-08-07 15:36:16
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咸花生

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
这种情况肯定是先检查质粒了，切开看看是不是正常

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2楼2023-08-07 08:25:57
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aaabndj

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 黄黑波波 at 2023-08-07 15:36:16
第一，扩基因用的酶扩增出的片段是平末端吗，有的酶扩增结束会在3‘加A;第二，平末端连接也应该使用T4连接酶才能连上吧，沒有磷酸二酯键形成不了质粒，线性片段转进菌裡很快就被降解了
...

这次用T4重做了，菌检有阳性，但是挑菌摇菌，第二天提质粒酶切验证的时候，又切不开

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4楼2023-08-13 14:04:32
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shuaibia6

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
好好核对一下载体和目的片段序列，序列不对你做一万次也没用
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5楼2023-08-14 14:54:51
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