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richenim金虫 (小有名气)
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[交流]
我做MTT，我的化合物怎么没有效果啊？
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你好！冒昧打搅了，看到你给关于救助MTT问题的回复，我有些关于MTT的问题想请教你下，谢谢！ 我也是用MTT法做一个文献报道的有抗癌活性的化合物对PC-3细胞的细胞毒性实验，但是结果却和文献报道的不同，一点效果都没有，也不知道是怎么回事。 我是这样操作的：前一天晚上接种于96孔板（100微升），第二天给药（按照文献报道的浓度选择了高、中、低三个浓度给药10微升），分别培养24h和48h后给MTT，孵育4h后弃去上清液加DMSO，振荡10min左右后用酶标仪测0D值（490nm），结果却是空白组、对照组、实验组的OD值接近（OD值在0.7左右），几乎没有差别，我做了几次都是这样的结果，我还同时选用苦参碱和槐果碱做了下对照，苦参碱和槐果碱都有很显著的抑制细胞活力的现象。我实在是不在知道我哪里出了问题，但就是没有结果，希望你能给点建议，谢谢！！！ 还想请问下如何可以检验我的化合物与MTT是否反应？在文献上没有报道我的化合物有还原性。 |
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HarveyWang
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很多外文文献都报道这个化合物是有抗癌活性的；我用的培养基是hams F12（GIBCO）和德国Biochrom的血清，怎么检验我的培养基是否会还原MTT啊？ 我的化合物是含有巯基和双键的化合物。 ps: “试验范围内不同浓度的该化合物+细胞培养基 混匀，跟MTT保温一定时间，最后测定终产物的吸光值。” 在跟MTT保温一定时间后也需要弃去上清液再加DMSO吗？如果弃去了上清液那不是什么都测不到了啊？ 我怀疑是不是我给药的剂量太少了啊，估计30微升的化合物要稀释100倍，才取10微升加入到培养板里。还有一个我怀疑的问题是我的化合物（脂溶性化合物）水溶性很不好，要先用DMSO溶解，但我每次用100微升的DMSO溶解后再加水，还是能看到漂浮的油状物，根本就没溶解完全，但DMSO量太大对细胞又有毒性。我实在是不知道还有什么原因了。 ------------------------------ （1）很多外文文献都报道这个化合物是有抗癌活性的；我用的培养基是hams F12（GIBCO）和德国Biochrom的血清，怎么检验我的培养基是否会还原MTT啊？ 我的化合物是含有巯基和双键的化合物。 解答： 如果很多人都能重复出相同的结论，而不是单独的一家实验室的结果，那还真要考虑是否是自己的操作有问题了。 血清肯定会对MTT 的还原反应产生影响，都是会还原MTT，是最终的OD读数增加的。 你的化合物含有巯基，很可能会使MTT反应的最终OD增加。 但是，血清或者你的巯基化合物使 MTT反应OD增加的这个速率，很可能要小于MTT被还原性的NADH/NADPH还原的速率。这个我做过实验。就是单纯的干扰反应的测定，没有细胞参与的。操作见下面的介绍。 （2）ps: “试验范围内不同浓度的该化合物+细胞培养基 混匀，跟MTT保温一定时间，最后测定终产物的吸光值。” 在跟MTT保温一定时间后也需要弃去上清液再加DMSO吗？如果弃去了上清液那不是什么都测不到了啊？ 解答： 操作略微不同于细胞的MTT活性测定。操作可见附图一。 我就是这么做干扰影响的。 反应是在1.5 mL EP管内进行，用PBS （50 mM， pH7.0）做缓冲（没有MTT干扰的能力的），然后加入干扰物 （这里就是不同浓度的巯基化合物，血清也可一样测定干扰能力） 然后加双蒸水和MTT母液，补足200 uL体积 37℃，暗处反应一定时间，反应液就会由黄色变成紫色（不溶物甲噆生成） 10000rpm, 60sec离心，可完全沉淀不溶物， 然后小心吸干净上清液，先加1000 uL DMSO完全溶解沉淀， 再用1000 uL 和500 uL清洗EP管，将紫色的DMSO倒入玻璃试管， 最后测定OD。 （3）我怀疑是不是我给药的剂量太少了啊，估计30微升的化合物要稀释100倍，才取10微升加入到培养板里。还有一个我怀疑的问题是我的化合物（脂溶性化合物）水溶性很不好，要先用DMSO溶解，但我每次用100微升的DMSO溶解后再加水，还是能看到漂浮的油状物，根本就没溶解完全，但DMSO量太大对细胞又有毒性。我实在是不知道还有什么原因了。 解答： 很可能是你加样时没有混匀哦！ 估计30微升的化合物要稀释100倍，才取10微升加入到培养板里 问题可能就出在这里，用水稀释后你的化合物又析出来啦！你吸取试剂的时候不均匀啊！所以先解决药物的溶解问题！ 文献是怎么做的啊？建议你直接加其DMSO溶解液或换用其他的有机溶剂。只能是按细胞能忍受的最高DMSO浓度加了。不过这样肯定要做三个加同样体积的DMSO的细胞对照孔。 [ Last edited by HarveyWang on 2009-10-5 at 08:34 ] |
4楼2009-10-05 08:30:37
HarveyWang
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 楼主MM有问题尽管问，解答如下： （1）楼主同时做了阳性对照，这说明不是你的操作问题。 而且用的是药物相同浓度时对相同细胞的影响。。。 你为啥不怀疑是那篇文章有猫腻呢。。。哈哈哈哈。。。 （2）MTT会跟培养基中的蛋白、多肽类物质有反应的。 这类物质通常也没人报道其还原性。 而且保温时间越长MTT被还原越多，最终生成的甲噆就越多。 血清培养基最好不含有干扰甲噆测定的其他有色物质。 （3）检验化合物A与MTT是否反应，真是很简单啊！ 你的化合物如果没有巯基之类的， 像单纯的萜类或不饱和双键很难会还原MTT！ 将试验范围内不同浓度的该化合物+细胞培养基 混匀， 跟MTT保温一定时间，（就像测定细胞活性的操作一样） 最后测定终产物的吸光值。 [ Last edited by HarveyWang on 2009-10-4 at 22:42 ] |
2楼2009-10-04 22:40:52
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谢谢你的建议！ 很多外文文献都报道这个化合物是有抗癌活性的；我用的培养基是hams F12（GIBCO）和德国Biochrom的血清，怎么检验我的培养基是否会还原MTT啊？ 我的化合物是含有巯基和双键的化合物。 ps: “试验范围内不同浓度的该化合物+细胞培养基 混匀，跟MTT保温一定时间，最后测定终产物的吸光值。” 在跟MTT保温一定时间后也需要弃去上清液再加DMSO吗？如果弃去了上清液那不是什么都测不到了啊？ 我怀疑是不是我给药的剂量太少了啊，估计30微升的化合物要稀释100倍，才取10微升加入到培养板里。还有一个我怀疑的问题是我的化合物（脂溶性化合物）水溶性很不好，要先用DMSO溶解，但我每次用100微升的DMSO溶解后再加水，还是能看到漂浮的油状物，根本就没溶解完全，但DMSO量太大对细胞又有毒性。我实在是不知道还有什么原因了。 希望给予指点，谢谢！ |
3楼2009-10-05 00:49:07
richenim
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