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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 我做MTT，我的化合物怎么没有效果啊？
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richenim

金虫 (小有名气)

[交流] 我做MTT，我的化合物怎么没有效果啊？

你好！冒昧打搅了，看到你给关于救助MTT问题的回复，我有些关于MTT的问题想请教你下，谢谢！
我也是用MTT法做一个文献报道的有抗癌活性的化合物对PC-3细胞的细胞毒性实验，但是结果却和文献报道的不同，一点效果都没有，也不知道是怎么回事。
我是这样操作的：前一天晚上接种于96孔板（100微升），第二天给药（按照文献报道的浓度选择了高、中、低三个浓度给药10微升），分别培养24h和48h后给MTT，孵育4h后弃去上清液加DMSO，振荡10min左右后用酶标仪测0D值（490nm），结果却是空白组、对照组、实验组的OD值接近（OD值在0.7左右），几乎没有差别，我做了几次都是这样的结果，我还同时选用苦参碱和槐果碱做了下对照，苦参碱和槐果碱都有很显著的抑制细胞活力的现象。我实在是不在知道我哪里出了问题，但就是没有结果，希望你能给点建议，谢谢！！！
还想请问下如何可以检验我的化合物与MTT是否反应？在文献上没有报道我的化合物有还原性。
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1楼2009-10-04 21:42:23
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HarveyWang

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Originally posted by richenim at 2009-10-4 21:42:
你好！冒昧打搅了，看到你给关于救助MTT问题的回复，我有些关于MTT的问题想请教你下，谢谢！
我也是用MTT法做一个文献报道的有抗癌活性的化合物对PC-3细胞的细胞毒性实验，但是结果却和文献报道的不同，一点效果 ...


楼主MM有问题尽管问，解答如下：

（1）楼主同时做了阳性对照，这说明不是你的操作问题。
而且用的是药物相同浓度时对相同细胞的影响。。。
你为啥不怀疑是那篇文章有猫腻呢。。。哈哈哈哈。。。

（2）MTT会跟培养基中的蛋白、多肽类物质有反应的。
这类物质通常也没人报道其还原性。
而且保温时间越长MTT被还原越多，最终生成的甲噆就越多。
血清培养基最好不含有干扰甲噆测定的其他有色物质。

（3）检验化合物A与MTT是否反应，真是很简单啊！
你的化合物如果没有巯基之类的，
像单纯的萜类或不饱和双键很难会还原MTT！

将试验范围内不同浓度的该化合物+细胞培养基 混匀，
跟MTT保温一定时间，（就像测定细胞活性的操作一样）
最后测定终产物的吸光值。

[ Last edited by HarveyWang on 2009-10-4 at 22:42 ]
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【我一直认为做土匪很性感很坏，很直接，可以大声喊：JCMM我爱你！所以，我自从博士毕业后，就一直在寻找黑道大哥一起去抢钱、抢粮、抢地盘】
2楼2009-10-04 22:40:52
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richenim

金虫 (小有名气)
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Originally posted by HarveyWang at 2009-10-4 22:40:



楼主MM有问题尽管问，解答如下：

（1）楼主同时做了阳性对照，这说明不是你的操作问题。
而且用的是药物相同浓度时对相同细胞的影响。。。
你为啥不怀疑是那篇文章有猫腻呢。。。哈哈哈哈。。。

...

谢谢你的建议！
很多外文文献都报道这个化合物是有抗癌活性的；我用的培养基是hams F12（GIBCO）和德国Biochrom的血清，怎么检验我的培养基是否会还原MTT啊？ 我的化合物是含有巯基和双键的化合物。

ps: “试验范围内不同浓度的该化合物+细胞培养基 混匀，跟MTT保温一定时间，最后测定终产物的吸光值。” 在跟MTT保温一定时间后也需要弃去上清液再加DMSO吗？如果弃去了上清液那不是什么都测不到了啊？

我怀疑是不是我给药的剂量太少了啊，估计30微升的化合物要稀释100倍，才取10微升加入到培养板里。还有一个我怀疑的问题是我的化合物（脂溶性化合物）水溶性很不好，要先用DMSO溶解，但我每次用100微升的DMSO溶解后再加水，还是能看到漂浮的油状物，根本就没溶解完全，但DMSO量太大对细胞又有毒性。我实在是不知道还有什么原因了。

希望给予指点，谢谢！
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3楼2009-10-05 00:49:07
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HarveyWang

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Originally posted by richenim at 2009-10-5 00:49:

谢谢你的建议！
很多外文文献都报道这个化合物是有抗癌活性的；我用的培养基是hams F12（GIBCO）和德国Biochrom的血清，怎么检验我的培养基是否会还原MTT啊？ 我的化合物是含有巯基和双键的化合物。

ps: “ ...

很多外文文献都报道这个化合物是有抗癌活性的；我用的培养基是hams F12（GIBCO）和德国Biochrom的血清，怎么检验我的培养基是否会还原MTT啊？ 我的化合物是含有巯基和双键的化合物。

ps: “试验范围内不同浓度的该化合物+细胞培养基 混匀，跟MTT保温一定时间，最后测定终产物的吸光值。” 在跟MTT保温一定时间后也需要弃去上清液再加DMSO吗？如果弃去了上清液那不是什么都测不到了啊？

我怀疑是不是我给药的剂量太少了啊，估计30微升的化合物要稀释100倍，才取10微升加入到培养板里。还有一个我怀疑的问题是我的化合物（脂溶性化合物）水溶性很不好，要先用DMSO溶解，但我每次用100微升的DMSO溶解后再加水，还是能看到漂浮的油状物，根本就没溶解完全，但DMSO量太大对细胞又有毒性。我实在是不知道还有什么原因了。
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（1）很多外文文献都报道这个化合物是有抗癌活性的；我用的培养基是hams F12（GIBCO）和德国Biochrom的血清，怎么检验我的培养基是否会还原MTT啊？ 我的化合物是含有巯基和双键的化合物。
解答：
如果很多人都能重复出相同的结论，而不是单独的一家实验室的结果，那还真要考虑是否是自己的操作有问题了。
血清肯定会对MTT 的还原反应产生影响，都是会还原MTT，是最终的OD读数增加的。
你的化合物含有巯基，很可能会使MTT反应的最终OD增加。

但是，血清或者你的巯基化合物使 MTT反应OD增加的这个速率，很可能要小于MTT被还原性的NADH/NADPH还原的速率。这个我做过实验。就是单纯的干扰反应的测定，没有细胞参与的。操作见下面的介绍。

（2）ps: “试验范围内不同浓度的该化合物+细胞培养基 混匀，跟MTT保温一定时间，最后测定终产物的吸光值。” 在跟MTT保温一定时间后也需要弃去上清液再加DMSO吗？如果弃去了上清液那不是什么都测不到了啊？

解答：
操作略微不同于细胞的MTT活性测定。操作可见附图一。
我就是这么做干扰影响的。
反应是在1.5 mL EP管内进行，用PBS （50 mM， pH7.0）做缓冲（没有MTT干扰的能力的），然后加入干扰物
（这里就是不同浓度的巯基化合物，血清也可一样测定干扰能力）
然后加双蒸水和MTT母液，补足200 uL体积

37℃，暗处反应一定时间，反应液就会由黄色变成紫色（不溶物甲噆生成）
10000rpm, 60sec离心，可完全沉淀不溶物，

然后小心吸干净上清液，先加1000 uL DMSO完全溶解沉淀，
再用1000 uL 和500 uL清洗EP管，将紫色的DMSO倒入玻璃试管，
最后测定OD。

（3）我怀疑是不是我给药的剂量太少了啊，估计30微升的化合物要稀释100倍，才取10微升加入到培养板里。还有一个我怀疑的问题是我的化合物（脂溶性化合物）水溶性很不好，要先用DMSO溶解，但我每次用100微升的DMSO溶解后再加水，还是能看到漂浮的油状物，根本就没溶解完全，但DMSO量太大对细胞又有毒性。我实在是不知道还有什么原因了。

解答：
很可能是你加样时没有混匀哦！
估计30微升的化合物要稀释100倍，才取10微升加入到培养板里
问题可能就出在这里，用水稀释后你的化合物又析出来啦！你吸取试剂的时候不均匀啊！所以先解决药物的溶解问题！
文献是怎么做的啊？建议你直接加其DMSO溶解液或换用其他的有机溶剂。只能是按细胞能忍受的最高DMSO浓度加了。不过这样肯定要做三个加同样体积的DMSO的细胞对照孔。

[ Last edited by HarveyWang on 2009-10-5 at 08:34 ]
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4楼2009-10-05 08:30:37
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richenim

金虫 (小有名气)
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Originally posted by HarveyWang at 2009-10-5 08:30:


很多外文文献都报道这个化合物是有抗癌活性的；我用的培养基是hams F12（GIBCO）和德国Biochrom的血清，怎么检验我的培养基是否会还原MTT啊？ 我的化合物是含有巯基和双键的化合物。

ps: “试验范围内不同 ...

那我先做一下这个干扰实验看看我的化合物是否对MTT有影响。问一下，最后转移到玻璃试管里，也是用酶标仪测OD值吗？我们实验室的酶标仪只能测96孔板、24孔板、12孔板等哦。
文献报道的一般都是用DMSO做有机溶剂的，只是DMSO的最终浓度有的是0.1%，有的是0.5%，也有用无水乙醇来做溶剂的。我再多查些文献看有没有其他溶剂。“只能是按细胞能忍受的最高DMSO浓度加了。不过这样肯定要做三个加同样体积的DMSO的细胞对照孔。”为什么要加三个啊？
呵呵。。。谢谢给你给了我怎么多建议啊！
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5楼2009-10-05 11:35:16
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HarveyWang

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Originally posted by richenim at 2009-10-5 11:35:



那我先做一下这个干扰实验看看我的化合物是否对MTT有影响。问一下，最后转移到玻璃试管里，也是用酶标仪测OD值吗？我们实验室的酶标仪只能测96孔板、24孔板、12孔板等哦。
文献报道的一般都是用DMSO做有机 ...

（1）
那我先做一下这个干扰实验看看我的化合物是否对MTT有影响。问一下，最后转移到玻璃试管里，也是用酶标仪测OD值吗？我们实验室的酶标仪只能测96孔板、24孔板、12孔板等哦。

解答：仔细看那个图哇！MM。
用分光光度计。你们肯定有的。
水不溶性的甲噆用 分析纯的 DMSO 有机溶剂 来完全溶解。溶解速度很快的，这个我试验过了，你不必再优化，很好用。


（2）文献报道的一般都是用DMSO做有机溶剂的，只是DMSO的最终浓度有的是0.1%，有的是0.5%，也有用无水乙醇来做溶剂的。我再多查些文献看有没有其他溶剂。“只能是按细胞能忍受的最高DMSO浓度加了。不过这样肯定要做三个加同样体积的DMSO的细胞对照孔。”为什么要加三个啊？
呵呵。。。谢谢给你给了我怎么多建议啊！

解答：
脂溶性的药物用无水乙醇溶解，估计够呛！
DMSO 最终可加到 0.5%。
就是说，200 uL 可以直接加 1uL DMSO溶解的药物。

所以你的那个化合物A 可以用DMSO来做溶解，到时用水稀释5倍左右，看看会有多少析出。如果可以，就可以加稀释液 5uL/孔。


为了做有效的DMSO抑制生长对照，要用同样稀释倍数的DMSO水溶液，
建议每次做三个孔，做重复啊。
你的药物抑制试验，是做的几个重复啊？
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6楼2009-10-05 15:12:29
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richenim

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Originally posted by HarveyWang at 2009-10-5 15:12:


（1）
那我先做一下这个干扰实验看看我的化合物是否对MTT有影响。问一下，最后转移到玻璃试管里，也是用酶标仪测OD值吗？我们实验室的酶标仪只能测96孔板、24孔板、12孔板等哦。

解答：仔细看那个 ...

我一般是30微升的化合物用100微升的DMSO溶解，再用100ml的水稀释，再没孔加10微升。（由于30微升化合物要溶解在100ml的水里才是所需的浓度，先用100微升的DMSO溶解，相当于DMSO的最终浓度为0.1%）
我一般做6个重复哦，呵呵。。。
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7楼2009-10-05 17:57:25
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louyiceng

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★
richenim(金币+1):谢谢参与
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Originally posted by HarveyWang at 2009-10-05 08:30:37:


很多外文文献都报道这个化合物是有抗癌活性的；我用的培养基是hams F12（GIBCO）和德国Biochrom的血清，怎么检验我的培养基是否会还原MTT啊？ 我的化合物是含有巯基和双键的化合物。

ps: “试验范围内不同 ...

谢谢
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8楼2010-03-18 07:56:41
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