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天兆9611铁虫 (小有名气)
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[求助]
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提取革兰氏阳性菌中pSIP 411质粒，按照天根高纯质粒小提取试剂盒方法提取，具体步骤如下： 1.柱平衡步骤：向吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中）加入500 µL的平衡液BL, 12,000 rpm离心1 min,倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 2.取2 mL过夜培养的菌液加入离心管中，12,000 rpm离心1 min,尽量吸除上清。 3.向留有菌体沉淀的离心管中加入500 µL溶液P1（已加入RNase A）,使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀，加入70 µL溶菌酶37 ℃处理30 min 。 4.向离心管中加入500 µL溶液P2,温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。 5.向离心管中加入700 µL溶液P3,立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。12,000 rpm离心10 min，此时在离心管底部形成沉淀。 6.将上一步收集的上清液分次加入过滤柱CS（过滤柱放入收集管中）, 12000 rpm离心2 min,小心地将离心后收集管中得到的溶液分次加入吸附柱CP4中 7.12,000 rpm离心1 min,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。 8.向吸附柱CP4中加入500 µL去蛋白液PD, 12000 rpm离心1 min,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。 9.向吸附柱CP4中加入600 µL漂洗液PW (已加入无水乙醇)，12000 rpm离心1 min,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。 10.重复操作步骤9 11.将吸附柱CP4重新放回收集管中置于12,000 rpm离心2 min,目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。 12.将吸附柱CP4置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加60 µL洗脱缓冲液TB,室温放置2 min, 12000 rpm离心1 min将质粒溶液收集到离心管中，将溶液再次加入到吸附膜上室温放置2 min，12000 rpm离心1 min之后保存在-20 ℃中。 以上提取完质粒后进行电泳，使用1%的胶，150 V 25 min（机器比较老了，以前150 V 15 min就可以了），染剂是gel red，之后照胶的图是这样的请问有大神支个招吗？需要做什么优化和改进？ |
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