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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 提取质粒求助
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【悬赏金币】回答本帖问题，作者天兆9611将赠送您 5 个金币

天兆9611

铁虫 (小有名气)

[求助] 提取质粒求助 已有1人参与

提取革兰氏阳性菌中pSIP 411质粒，按照天根高纯质粒小提取试剂盒方法提取，具体步骤如下：

1.柱平衡步骤：向吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中）加入500 µL的平衡液BL, 12,000 rpm离心1 min,倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
2.取2 mL过夜培养的菌液加入离心管中，12,000 rpm离心1 min,尽量吸除上清。
3.向留有菌体沉淀的离心管中加入500 µL溶液P1（已加入RNase A）,使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀，加入70 µL溶菌酶37 ℃处理30 min
。
4.向离心管中加入500 µL溶液P2,温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
5.向离心管中加入700 µL溶液P3,立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。12,000 rpm离心10 min，此时在离心管底部形成沉淀。
6.将上一步收集的上清液分次加入过滤柱CS（过滤柱放入收集管中）, 12000 rpm离心2 min,小心地将离心后收集管中得到的溶液分次加入吸附柱CP4中
7.12,000 rpm离心1 min,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。
8.向吸附柱CP4中加入500 µL去蛋白液PD, 12000 rpm离心1 min,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。
9.向吸附柱CP4中加入600 µL漂洗液PW (已加入无水乙醇)，12000 rpm离心1 min,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。
10.重复操作步骤9
11.将吸附柱CP4重新放回收集管中置于12,000 rpm离心2 min,目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
12.将吸附柱CP4置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加60 µL洗脱缓冲液TB,室温放置2 min, 12000 rpm离心1 min将质粒溶液收集到离心管中，将溶液再次加入到吸附膜上室温放置2 min，12000 rpm离心1 min之后保存在-20 ℃中。

以上提取完质粒后进行电泳，使用1%的胶，150 V 25 min（机器比较老了，以前150 V 15 min就可以了），染剂是gel red，之后照胶的图是这样的请问有大神支个招吗？需要做什么优化和改进？
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懵懂的小白
1楼 2023-06-12 16:10:24
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天兆9611

铁虫 (小有名气)
图片

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懵懂的小白
2楼2023-06-12 16:16:45
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天兆9611

铁虫 (小有名气)
图片怎么发不出去，服务器连接异常

发自小木虫Android客户端
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懵懂的小白
3楼2023-06-12 16:25:39
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hutil1543

金虫 (小有名气)
直接文字描述问题呗
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4楼2023-06-15 16:57:08
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天兆9611

铁虫 (小有名气)
结果是一个沿着泳道的长明亮带，带中间亮两头偏暗。
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懵懂的小白
5楼2023-06-16 10:37:32
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syyyyss

新虫 (初入文坛)
楼主可以试一下简石生物的试剂盒

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6楼2023-09-11 08:37:14
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tybo

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

初步判断是提取的问题，建议楼主试一下慧庆生物的质粒DNA快速提取试剂(磁珠法)。
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7楼2023-10-19 09:26:22
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