| 查看: 1775 | 回复: 12 | |||||
| 当前主题已经存档。 | |||||
guyue2885银虫 (正式写手)
|
[交流]
菌液PCR假阳性的多么
|
||||
| 蓝白斑筛选后，菌液PCR，后直接对阳性结果进行测序，不做酶切，可行否？菌液PCR假阳性的多么？ |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 分子生化实验经验积累 | 核酸生物学实验经验 |
» 猜你喜欢
欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律
已经有15人回复
-
澳大利亚 Murdoch University 全奖博士招生（3个名额）地质化工冶金领域
已经有20人回复
-
静等基金结果
已经有21人回复
-
FileCode能看出啥？
已经有28人回复
-
阿姨
已经有3人回复
-
有时候，自然基金真的不能太认真 （我的申报经验）
已经有6人回复
-
filecode
已经有16人回复
-
重要来源：本周末出结果
已经有10人回复
-
咱们一起用铁证分析2026国家社科基金中标与否
已经有6人回复
-
不应该看fileCode
已经有9人回复
2楼2009-09-30 09:35:31
HarveyWang
捐助贵宾 (知名作家)
海外行者
- BioEPI: 14
- 应助: 80 (初中生)
- 金币: 2277.2
- 散金: 24
- 红花: 65
- 帖子: 6880
- 在线: 946小时
- 虫号: 528557
- 注册: 2008-03-19
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
|
楼主，假阳性会很多，常见的。下面的人跟你有同样的问题。 --------------------------------- 每次菌液PCR后我都做了酶切鉴定，发现是假阳性。 我现在想请教的是，出现这种假阳性的原因。 因为实验过程中每一步都做了对照，从实验过程的每一步来看，都很正常，但就是酶切或者测序时就会发现是假阳性。 另外，我有一次做了5个不同的文库，有2个是正常的，另外3个文库全部是假阳性。我先做96空板菌液PCR筛选，然后拿阳性的菌液PCR产物酶切，酶切结果发现所有的阳性产物均是假阳性。不知道问题出在哪里了！ ------------------------------------- 所以，要严格按照下面的顺序来做的： 蓝白斑（或抗性筛选）---菌落PCR---提质粒酶切---蛋白表达---质粒测序 因为前面的几个程序自己可以做啊， 这些步骤就都要做过一遍， 没有问题了，就送出去测序，最终序列正确才算成功的。  假阳性的原因，下面google的，说的很全，可以参考。  -------------------------------------------------------------- 1.用片段上的特异引物是不能用来做菌落PCR的，因为你的平板上就有很多目的片段。 2.用载体上的引物一般来说是没什么问题的，有特殊的情况。如果你的片段和载体差不多大，最好不用，因为会有反向PCR的情况。你的片段是1800bp，应该是没问题的。 3.可以考虑一个片段上的特异引物，一个载体上的引物。特异性会高，而且连连接方向都鉴定出来了，呵呵。 4.提质粒后加一个空载体的对照，一样大的就不用酶切鉴定了。 5.导致这种假阳性原因很多，也可能是片段结构的问题。 6.实在不行可以委托进行技术服务，现在的技术服务也不贵 [ Last edited by HarveyWang on 2009-10-1 at 02:42 ] |
8楼2009-09-30 17:56:46
十比
木虫 (著名写手)
- BioEPI: 1
- 应助: 39 (小学生)
- 金币: 3209.9
- 散金: 1125
- 红花: 5
- 帖子: 1204
- 在线: 569小时
- 虫号: 221737
- 注册: 2006-03-20
- 性别: GG
- 专业: 植物学研究的新技术、新方
3楼2009-09-30 11:27:36
wordsworth3180
木虫 (正式写手)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 3624.4
- 帖子: 703
- 在线: 337.8小时
- 虫号: 568607
- 注册: 2008-06-03
- 性别: MM
- 专业: 微生物生理与生物化学
4楼2009-09-30 12:58:24
gnice
金虫 (正式写手)
- 应助: 6 (幼儿园)
- 金币: 1573.9
- 散金: 5
- 红花: 3
- 帖子: 324
- 在线: 154.8小时
- 虫号: 43496
- 注册: 2004-04-10
- 专业: 微生物生理与生物化学
5楼2009-09-30 13:51:37
6楼2009-09-30 16:10:27
tangtl
木虫 (正式写手)
小木虫潜水者
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 2555.2
- 散金: 30
- 红花: 1
- 帖子: 370
- 在线: 22.5小时
- 虫号: 423004
- 注册: 2007-07-21
- 性别: GG
- 专业: 化学环境污染与健康
7楼2009-09-30 17:41:15
guyue2885
银虫 (正式写手)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 1474.2
- 散金: 8
- 帖子: 412
- 在线: 46.6小时
- 虫号: 712946
- 注册: 2009-03-02
- 性别: GG
- 专业: 生物
9楼2009-09-30 19:35:17
mascotte
金虫 (正式写手)
- BioEPI: 2
- 应助: 10 (幼儿园)
- 金币: 1998.9
- 红花: 3
- 帖子: 328
- 在线: 193.4小时
- 虫号: 492008
- 注册: 2008-01-07
- 专业: 生物化学
10楼2009-09-30 23:32:48
