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guyue2885银虫 (正式写手)
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菌液PCR假阳性的多么
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| 蓝白斑筛选后，菌液PCR，后直接对阳性结果进行测序，不做酶切，可行否？菌液PCR假阳性的多么？ |
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 分子生化实验经验积累 | 核酸生物学实验经验 |
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2楼2009-09-30 09:35:31
HarveyWang
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楼主，假阳性会很多，常见的。下面的人跟你有同样的问题。 --------------------------------- 每次菌液PCR后我都做了酶切鉴定，发现是假阳性。 我现在想请教的是，出现这种假阳性的原因。 因为实验过程中每一步都做了对照，从实验过程的每一步来看，都很正常，但就是酶切或者测序时就会发现是假阳性。 另外，我有一次做了5个不同的文库，有2个是正常的，另外3个文库全部是假阳性。我先做96空板菌液PCR筛选，然后拿阳性的菌液PCR产物酶切，酶切结果发现所有的阳性产物均是假阳性。不知道问题出在哪里了！ ------------------------------------- 所以，要严格按照下面的顺序来做的： 蓝白斑（或抗性筛选）---菌落PCR---提质粒酶切---蛋白表达---质粒测序 因为前面的几个程序自己可以做啊， 这些步骤就都要做过一遍， 没有问题了，就送出去测序，最终序列正确才算成功的。  假阳性的原因，下面google的，说的很全，可以参考。  -------------------------------------------------------------- 1.用片段上的特异引物是不能用来做菌落PCR的，因为你的平板上就有很多目的片段。 2.用载体上的引物一般来说是没什么问题的，有特殊的情况。如果你的片段和载体差不多大，最好不用，因为会有反向PCR的情况。你的片段是1800bp，应该是没问题的。 3.可以考虑一个片段上的特异引物，一个载体上的引物。特异性会高，而且连连接方向都鉴定出来了，呵呵。 4.提质粒后加一个空载体的对照，一样大的就不用酶切鉴定了。 5.导致这种假阳性原因很多，也可能是片段结构的问题。 6.实在不行可以委托进行技术服务，现在的技术服务也不贵 [ Last edited by HarveyWang on 2009-10-1 at 02:42 ] |
8楼2009-09-30 17:56:46
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3楼2009-09-30 11:27:36
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4楼2009-09-30 12:58:24
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9楼2009-09-30 19:35:17
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