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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 测序双峰问题
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superman.6

新虫 (小有名气)

[求助] 测序双峰问题 已有2人参与

菌落pcr（引物27f/1492r），前后两次测序结果都是正向正常，反向重叠峰。第一次出现这种情况后，我把我的菌种继续纯化了，但是第二次还是这样的结果，不知道什么原因了

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1楼 2023-04-25 22:27:16
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KM石头

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼主这个是测16s吧，你测序的引物是自己送到还是使用测序公司的，如果是自己的建议检查自己的引物是否有问题（是否污染）；第二种方法，建议将PCR产物连到T载体上，再送质粒去测序，干扰会少很多
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3楼2023-04-26 10:18:22
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Glenice Y

新虫 (正式写手)
为什么不送质粒测序，还是这个比较特殊

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2楼2023-04-25 23:58:10
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superman.6

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by KM石头 at 2023-04-26 10:18:22
楼主这个是测16s吧，你测序的引物是自己送到还是使用测序公司的，如果是自己的建议检查自己的引物是否有问题（是否污染）；第二种方法，建议将PCR产物连到T载体上，再送质粒去测序，干扰会少很多

好的，谢谢。我想再问问，出现一端正常，一端重叠峰的情况，可以排除我的dna模板不纯的问题吗

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4楼2023-04-26 10:35:34
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shuaibia6

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
有一种情况可以解释，就是你的菌落不纯，打个比方就是你的菌有2种，一种是A链正常的，一种是A链缺失的，它们的互补链B链都是正常的。这样你其中一条引物测序测的是A链，所以测序正常，另一条链测的是B链，因为存在2种型，一个正常一种缺失，所以测序结果是双峰。这种情况我建议你摇菌点单菌落，再提取单菌落再测序就没问题了。
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5楼2023-04-27 16:55:10
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