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myn

银虫 (小有名气)

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[交流] 求助内切酶

2类限制性核酸内切酶的的作用机理是什么？所含的金属离子起什么作用

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1楼2009-09-27 16:08:01

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louyiceng

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2楼2010-03-15 08:01:32

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mxbeaver

木虫 (著名写手)

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限制性酶主要分为三种类型：Ⅰ型限制酶为复合功能酶，具有限制-修饰两种功能，但在 DNA链上没有固定的切割位点，一般在离切割位点1kb到几kb的地方随机切割，不产生特异性片段。Ⅲ型酶与Ⅰ型酶基本相似，不同的是Ⅲ型酶有特异性的切割位点，但这两类酶对 DNA酶切分析的意义不大。
通常所说的限制性内切酶是指Ⅱ型酶，它能够识别与切割DNA链上的特定的核苷酸顺序，产生特异性的DNA片段。
限制性酶的识别序列，大部分具有双轴对称性结构或称回文序列。关于识别原理，参考：蛋白质对ＤＮＡ识别的模体中，除了锌指结构，螺旋－转角－螺旋，亮氨酸拉链和β带外，近年来发现，Ⅱ型限制性内切酶ＤＮＡ作用的模体有许多特别之处。通过对ＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＶ等与ＤＮＡ复合物的空间构象，一级结构分析，发现酶分子存在催化性裂缝，并且氨基端形成臂结构包绕ＤＮＡ；同时ＤＮＡ发生构象变化，螺旋扭结。
限制性酶不但有特定的识别序列，并且任何一种酶切割 DNA链时，总是水解核苷酸3’和5’-磷酸二酯键的3’位磷酸酯键，使产物的5’端带磷酸单酯基团，而3’末端则为游离羟基。因此某一种酶的全部产物的末端具有相同的结构。

关于金属离子，它不是含在酶里面的，而是酶作用时所需的缓冲液里面的。它的作用也就是金属离子对于酶的作用：作为激活剂，提高酶活性。
激活剂作用包括两种情况: 一种是由于激活剂的存在, 使一些本来有活性的酶活性进一步提高, 这一类激活剂主要是离子或简单有机化合物. 另一种是激活酶原,无活性→有活性,这一类激活剂可能是离子或蛋白质. 1, 无机离子的激活作用 (1)金属离子:K+ ,Na+,Mg2+ ,Zn2+,Fe 2+ ,Ca2+ (2)阴离子:cl-,Br (3)氢离子许多金属离子是酶的辅助因子,是酶的组成成分,参与催化反应中的电子传递. 有些金属离子可与酶分子肽链上侧链基团结合,稳定酶分子的活性构象. 有的金属离子通过生成螯合物,在酶与底物结合中起桥梁作用. 注意: (1) 无机离子的激活作用具有选择性,不同的离子激活不同的酶. (2) 不同离子之间有拮抗作用,如 Na+与 K+,Mg+与 Ca+,但 Mg+与 Zn+常可替代. (3) 激活剂的浓度要适中,过高往往有抑制作用,1~50mM 2, 简单有机分子的激活作用 ①还原剂(如 Cys,还原型谷胱甘肽)能激活某些活性中心含有—SH 的酶. ②金属螯合剂(EDTA)能去除酶中重金属离子,解除抑制作用.