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墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫

[交流] PCR直接得到质粒?

各位虫友,通过PCR这样能直接得到质粒吗:将某经突变的目的片段(~800bp)作为引物,以含有该原始目的片段的质粒为模板,PCR?因为是转酵母,所以想直接得到质粒,再线性化电转化,这样行吗:(
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仕不可不弘毅,任重而道远
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)


墨香若水(金币+1,VIP+0):谢谢交流~用Pfu突变几率应该不高吧,你指的会突变是什么: 我是想将我的突变文库转酵母,所以想用这个方法: 9-25 16:20
会突变的……做一下克隆能有多难?
2楼2009-09-25 16:07:40
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bioxixi

木虫 (著名写手)


墨香若水(金币+1,VIP+0):打击我啊,多谢交流~ 9-26 22:34
可以吗?都能P出花来了。。。
楼主成功的话再上个帖子分享下吧
3楼2009-09-25 16:36:23
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xiaricha

银虫 (小有名气)


墨香若水(金币+1,VIP+0):你做过麽: 9-26 22:34
可以的
4楼2009-09-25 16:59:54
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)


墨香若水(金币+1,VIP+0):多谢交流 9-26 22:35
pfu是有保真性,但是对于长片段PCR的能力比较差
5楼2009-09-25 18:16:16
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)


墨香若水(金币+1,VIP+0)::( 9-26 22:35
可以的。但PCR产物得先转化大肠,再提质粒
6楼2009-09-25 19:24:10
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)


墨香若水(金币+1,VIP+0):多谢交流~ 9-26 22:36
楼主,你真有想象力啊!我们用的酶没有那么强的聚合能力,不能拉出那么长的序列,即使可以突变也是很多的。你直接用你的突变序列把质粒上的序列替换掉不就行了吗?
7楼2009-09-25 19:56:12
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kitty8682

金虫 (正式写手)

★ ★
墨香若水(金币+2,VIP+0):原始甲基化的模板,能说再具体点吗: 9-26 22:37
可以的,P出来之后,先用DPn1消化掉原始甲基化的模板,再转化大肠杆菌,抽质粒测序,p的时候由于片段很长,最好用高保真酶
8楼2009-09-26 09:04:39
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小瞥

铁虫 (小有名气)


墨香若水(金币+1,VIP+0):如果能得到线性的更好,还免去了线性化:关键是能P出来否。 9-26 22:38
不是的。pcr出来只是线性的片段,需要转化才能成为质粒
9楼2009-09-26 09:12:32
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lzhwin

木虫 (正式写手)

可以的啊,PFU酶的保真度足够做这样的实验,就是时间非常长一轮PCR下来要5 6个小时吧?

不过一般只有在做点突变研究氨基酸功能的时候才这样做吧?一般想突变菌的基因只需要先吧基因扩出来,然后在里面插一个抗性基因再同源重组会细菌就可以了,不用这么麻烦。
10楼2009-09-28 19:30:59
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