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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » PCR直接得到质粒？
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墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫

[交流] PCR直接得到质粒？

各位虫友，通过PCR这样能直接得到质粒吗：将某经突变的目的片段（~800bp）作为引物，以含有该原始目的片段的质粒为模板，PCR？因为是转酵母，所以想直接得到质粒，再线性化电转化，这样行吗:（
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仕不可不弘毅，任重而道远
1楼 2009-09-25 15:36:29
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
墨香若水(金币+1,VIP+0):谢谢交流~用Pfu突变几率应该不高吧，你指的会突变是什么： 我是想将我的突变文库转酵母，所以想用这个方法： 9-25 16:20
会突变的……做一下克隆能有多难？
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2楼2009-09-25 16:07:40
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bioxixi

木虫 (著名写手)
★
墨香若水(金币+1,VIP+0):打击我啊，多谢交流~ 9-26 22:34
可以吗？都能P出花来了。。。
楼主成功的话再上个帖子分享下吧
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3楼2009-09-25 16:36:23
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xiaricha

银虫 (小有名气)
★
墨香若水(金币+1,VIP+0):你做过麽： 9-26 22:34
可以的
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4楼2009-09-25 16:59:54
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
墨香若水(金币+1,VIP+0):多谢交流 9-26 22:35
pfu是有保真性，但是对于长片段PCR的能力比较差
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5楼2009-09-25 18:16:16
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)
★
墨香若水(金币+1,VIP+0):：（ 9-26 22:35
可以的。但PCR产物得先转化大肠，再提质粒
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6楼2009-09-25 19:24:10
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
★
墨香若水(金币+1,VIP+0):多谢交流~ 9-26 22:36
楼主，你真有想象力啊！我们用的酶没有那么强的聚合能力，不能拉出那么长的序列，即使可以突变也是很多的。你直接用你的突变序列把质粒上的序列替换掉不就行了吗？
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7楼2009-09-25 19:56:12
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kitty8682

金虫 (正式写手)
★ ★
墨香若水(金币+2,VIP+0):原始甲基化的模板，能说再具体点吗： 9-26 22:37
可以的，P出来之后，先用DPn1消化掉原始甲基化的模板，再转化大肠杆菌，抽质粒测序，p的时候由于片段很长，最好用高保真酶
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8楼2009-09-26 09:04:39
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小瞥

铁虫 (小有名气)
★
墨香若水(金币+1,VIP+0):如果能得到线性的更好，还免去了线性化：关键是能P出来否。 9-26 22:38
不是的。pcr出来只是线性的片段，需要转化才能成为质粒
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9楼2009-09-26 09:12:32
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lzhwin

木虫 (正式写手)
可以的啊，PFU酶的保真度足够做这样的实验，就是时间非常长一轮PCR下来要5 6个小时吧？

不过一般只有在做点突变研究氨基酸功能的时候才这样做吧？一般想突变菌的基因只需要先吧基因扩出来，然后在里面插一个抗性基因再同源重组会细菌就可以了，不用这么麻烦。
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10楼2009-09-28 19:30:59
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