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几个基因工程制药的问题
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| 大家知不知道基因工程制药的步骤，工程菌的生长代谢特点和培养方式，如何获得药用蛋白质基因并表达，我们老师要我们回答的，我不知道。。。。 |
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目的基因的获得 一,逆转录法 逆转录法是先分离纯化目的基因的mRNA,再反转录成cDNA,然后进行cDNA的克隆表达. 1,mRNA的纯化 mRNA的特点:3'末端含有一多聚腺苷酸组成的末端. 方法:亲和层析法 2,cDNA第一链的合成 一般 mRNA都带有3'-polyA,所以可以用寡聚dT作为引物,在逆转录酶的催化下,开始cDNA链的合成. 用放射性探针法检测. 3,cDNA第二链的合成 以cDNA第一链为模板合成第二链. 4,cDNA克隆 用于cDNA克隆的载体有两类:质粒DNA和噬菌体.又将其分为表达型载体和非表达型载体.选用表达型载体可以增加目的基因的筛选方法,有利于目的基因的筛选. cDNA片段与载体的连接通常采用下面方法: 加同聚尾连接:在载体和cDNA的3'末端加上互补的同型多聚酶序列. 人工接头连接:所谓人工接头是指用人工合成的,连接在目的基因两端的含有某些限制酶切点的寡核苷酸片断. 5,将重组体导入宿主细胞 6, cDNA文库的鉴定 7,目的cDNA克隆的分离和鉴定 (1)核酸探针杂交法 (2)免疫反应鉴定法 逆转录-聚合酶反应法.该方法是mRNA经逆转录合成cDNA第一链,不需再合成第二链,而是在特异引物的协助下,用PCR法进行扩增,特异地合成目的cDNA链,用于重组,克隆. 二,化学合成法 前提:较小的蛋白质或多肽的编码基因,必须知道目的基因的核苷酸排列顺序,或知道目的蛋白质的氨基酸顺序,再按相应的密码子推导出DNA的碱基序列. 操作:见书 限制:一,不能合成太长的基因. 二,人工合成基因时,遗传密码的简并会为选择密码子带来很大的困难. 三,费用高 基因表达 基因表达是指结构基因在生物体中的转录,翻译以及所有加工过程. 基因表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动,即剪切下一个外源基因片断,拼接到另一个基因表达体系中,使其能获得既有原生物活性又可高产的表达产物. 一,宿主细胞的选择 宿主细胞应满足的要求: 分类:第一类为原核细胞,如大肠杆菌等;第二类为真核细胞,如酵母等. 1,原核细胞 (1)大肠杆菌:目前采用最多的原核表达体系. (2)枯草芽孢杆菌 (3)链霉菌 2,真核细胞 (1)酵母:酿酒酵母应用广泛. (2)丝状真菌 (3)哺乳动物细胞 二,大肠杆菌中的基因表达 1,载体 表达载体必须具备的条件: (1)载体能够独立的复制 (2)具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记 (3)具有很强的启动子 (4)具有阻遏子 (5)有很强的终止子 (6)有翻译的起始信号 常用的表达载体: (1)pBV220系统 (2)pET系统 2,影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素 (1)外源基因的拷贝数 (2)外源基因的表达效率 ①启动子的强弱 ②核糖体结合位点 ③SD序列和起始密码子ATG的间距 ④密码子组成 (3)表达产物的稳定性 (4)细胞的代谢负荷 (5)工程菌的培养条件 3,真核基因在大肠杆菌中的表达形式 (1)以融合蛋白的表达形式表达药物基因 由一段短的原核多肽和真核蛋白结合在一起的蛋白质,称为融合蛋白. (2)以非融合蛋白的形式表达药物基因 (3)分泌型表达蛋白药物基因 三,酵母中的基因表达 1,载体 (1)载体的复制序列 包括YEp类,YRp类,YRp类和YIp类. (2)克隆载体 由于从大肠杆菌中制备质粒比从酵母中容易,所以酵母质粒的加工和制备大部分是通过大肠杆菌进行的. (3)表达载体 包括普通表达载体和精确表达载体. 2,影响目的基因在酵母菌中表达的因素 (1)外源基因的拷贝数 (2)外源基因的表达效率 主要与启动子,分泌信号和终止序列有关. (3)外源蛋白的糖基化 (4)宿主菌株的影响 表达用的酵母宿主菌应具备①菌体生长力强.②菌体内蛋白酶要较弱.③菌株性能稳定.④ 分泌能力强. 四,动物细胞中的基因表达 |
2楼2009-09-24 13:20:16
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3楼2009-09-24 15:44:05
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