| 查看: 442 | 回复: 5 | |||
| 当前主题已经存档。 | |||
[交流]
几个基因工程制药的问题
|
|||
| 大家知不知道基因工程制药的步骤，工程菌的生长代谢特点和培养方式，如何获得药用蛋白质基因并表达，我们老师要我们回答的，我不知道。。。。 |
回复此楼» 猜你喜欢
筑牢营养安全线：以精准检测，护健康基石
已经有0人回复
-
推荐一些20种氨基酸检测的实际应用案例
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有223人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
dingqian03
银虫 (小有名气)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 633
- 红花: 1
- 沙发: 1
- 帖子: 277
- 在线: 14.6小时
- 虫号: 851093
- 注册: 2009-09-18
- 性别: GG
- 专业: 蔬菜学与瓜果学
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
|
目的基因的获得 一,逆转录法 逆转录法是先分离纯化目的基因的mRNA,再反转录成cDNA,然后进行cDNA的克隆表达. 1,mRNA的纯化 mRNA的特点:3'末端含有一多聚腺苷酸组成的末端. 方法:亲和层析法 2,cDNA第一链的合成 一般 mRNA都带有3'-polyA,所以可以用寡聚dT作为引物,在逆转录酶的催化下,开始cDNA链的合成. 用放射性探针法检测. 3,cDNA第二链的合成 以cDNA第一链为模板合成第二链. 4,cDNA克隆 用于cDNA克隆的载体有两类:质粒DNA和噬菌体.又将其分为表达型载体和非表达型载体.选用表达型载体可以增加目的基因的筛选方法,有利于目的基因的筛选. cDNA片段与载体的连接通常采用下面方法: 加同聚尾连接:在载体和cDNA的3'末端加上互补的同型多聚酶序列. 人工接头连接:所谓人工接头是指用人工合成的,连接在目的基因两端的含有某些限制酶切点的寡核苷酸片断. 5,将重组体导入宿主细胞 6, cDNA文库的鉴定 7,目的cDNA克隆的分离和鉴定 (1)核酸探针杂交法 (2)免疫反应鉴定法 逆转录-聚合酶反应法.该方法是mRNA经逆转录合成cDNA第一链,不需再合成第二链,而是在特异引物的协助下,用PCR法进行扩增,特异地合成目的cDNA链,用于重组,克隆. 二,化学合成法 前提:较小的蛋白质或多肽的编码基因,必须知道目的基因的核苷酸排列顺序,或知道目的蛋白质的氨基酸顺序,再按相应的密码子推导出DNA的碱基序列. 操作:见书 限制:一,不能合成太长的基因. 二,人工合成基因时,遗传密码的简并会为选择密码子带来很大的困难. 三,费用高 基因表达 基因表达是指结构基因在生物体中的转录,翻译以及所有加工过程. 基因表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动,即剪切下一个外源基因片断,拼接到另一个基因表达体系中,使其能获得既有原生物活性又可高产的表达产物. 一,宿主细胞的选择 宿主细胞应满足的要求: 分类:第一类为原核细胞,如大肠杆菌等;第二类为真核细胞,如酵母等. 1,原核细胞 (1)大肠杆菌:目前采用最多的原核表达体系. (2)枯草芽孢杆菌 (3)链霉菌 2,真核细胞 (1)酵母:酿酒酵母应用广泛. (2)丝状真菌 (3)哺乳动物细胞 二,大肠杆菌中的基因表达 1,载体 表达载体必须具备的条件: (1)载体能够独立的复制 (2)具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记 (3)具有很强的启动子 (4)具有阻遏子 (5)有很强的终止子 (6)有翻译的起始信号 常用的表达载体: (1)pBV220系统 (2)pET系统 2,影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素 (1)外源基因的拷贝数 (2)外源基因的表达效率 ①启动子的强弱 ②核糖体结合位点 ③SD序列和起始密码子ATG的间距 ④密码子组成 (3)表达产物的稳定性 (4)细胞的代谢负荷 (5)工程菌的培养条件 3,真核基因在大肠杆菌中的表达形式 (1)以融合蛋白的表达形式表达药物基因 由一段短的原核多肽和真核蛋白结合在一起的蛋白质,称为融合蛋白. (2)以非融合蛋白的形式表达药物基因 (3)分泌型表达蛋白药物基因 三,酵母中的基因表达 1,载体 (1)载体的复制序列 包括YEp类,YRp类,YRp类和YIp类. (2)克隆载体 由于从大肠杆菌中制备质粒比从酵母中容易,所以酵母质粒的加工和制备大部分是通过大肠杆菌进行的. (3)表达载体 包括普通表达载体和精确表达载体. 2,影响目的基因在酵母菌中表达的因素 (1)外源基因的拷贝数 (2)外源基因的表达效率 主要与启动子,分泌信号和终止序列有关. (3)外源蛋白的糖基化 (4)宿主菌株的影响 表达用的酵母宿主菌应具备①菌体生长力强.②菌体内蛋白酶要较弱.③菌株性能稳定.④ 分泌能力强. 四,动物细胞中的基因表达 |
2楼2009-09-24 13:20:16
lxj341401
至尊木虫 (著名写手)
- MolEPI: 58
- 应助: 388 (硕士)
- 贵宾: 0.238
- 金币: 17138.7
- 红花: 43
- 帖子: 2251
- 在线: 712.4小时
- 虫号: 111074
- 注册: 2005-11-20
- 专业: 生物化学
3楼2009-09-24 15:44:05
4楼2009-09-24 22:47:56
qqsvery
木虫 (著名写手)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 2895.9
- 红花: 3
- 帖子: 1688
- 在线: 18.6小时
- 虫号: 592166
- 注册: 2008-09-03
- 专业: 造血、造血调控与造血微环
5楼2009-10-31 11:05:09
9528
至尊木虫 (职业作家)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 13134.5
- 散金: 1201
- 红花: 20
- 沙发: 1
- 帖子: 3658
- 在线: 426.8小时
- 虫号: 117447
- 注册: 2005-11-26
- 专业: 天文技术和方法
6楼2009-11-01 09:44:12