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求细胞裂解液的配制方法
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细胞裂解液中的SDS是什么东西啊？配制方法有国标吗？能不能把标准发过来看看，谢谢了。 [ Last edited by wwtp on 2009-10-13 at 09:43 ] |
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2楼2009-09-22 17:21:02
3楼2009-10-13 09:56:49
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sxdxrhyy(金币+1,VIP+0):xiexie 10-13 12:48
sxdxrhyy(金币+1,VIP+0):xiexie 10-13 12:48
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1．1M Tris 溶液的配置 取Tris242.2g，加ddH2O至1600ml，加热溶解。 2．1M Tris－HCL Ph=8.0溶液的配置 取 1M Tris 溶液160ml用分析纯盐酸调至Ph=8.0（需浓盐酸约8.5ml），加ddH2O定容至200ml，高压灭菌备用。 3. 0.5M EDTA溶液的配置 称EDTA－Na2 37.2g 先用140ml ddH2O溶解，加入14ml NaOH（10M）使EDTA－Na2溶解，再用NaOH（10M）溶液调至Ph=8.0，加ddH2O定容至200ml，高压灭菌备用。 4. 细胞裂解液的配制 称15gCTAB（Hexadecyltrimethylammonium bromide）（先用约600ml ddH2O加热溶解）放入烧杯中，加入75ml 1M Tris－HCL（Ph=8.0），58.5g NaCL（先用少量ddH2O溶解），30ml 0.5M EDTA，定容至1000ml，混合均匀备用。 |
4楼2009-10-13 10:03:34
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细胞裂解液的主要目的：1.利用去污剂破坏脂质双分子层，破裂细胞；2. 溶解蛋白；3. 蛋白变性使其稳定；4. 抑制蛋白酶活性 推荐RIPA buffer: . 50 mM Tris-HCl pH 7.4 缓冲体系 · 150 mM NaCl 等渗体系 · 1 mM PMSF 强大的蛋白酶抑制剂 · 1 mM EDTA 变性剂和稳定剂 · 5 µg/ml Aprotinin 蛋白酶抑制剂 · 5 µg/ml Leupeptin 蛋白酶抑制剂 · 1% Triton x-100 破坏细胞 ·1% Sodium deoxycholate 中度变性剂和蛋白溶解剂 ·0.1% SDS 强变性剂和蛋白溶解剂 其中PMSF等蛋白酶抑制剂最好另外配制，－20℃保存，用前混合。蛋白酶抑制剂较贵，如果你的经费有限，可以仅用PMSF试一试，能出结果就可以。 |
5楼2009-10-13 10:05:13
6楼2009-10-13 10:05:39
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amisking(金币+2,VIP+0): 10-13 11:40
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1.4.2.2 细菌破壁方法 细菌破壁是成功提取DNA的关键步骤之一。革兰氏阳性菌的肽聚糖层构成坚韧的三维立体结构,而阴性菌肽聚糖层构成疏松的二维结构,因此不同种类细菌的破壁方法不同。目前破壁方法有十二烷基磺酸钠(SDS)裂解法、溶菌酶法、反复冻融法、研磨法、超声波法等。不同细菌对溶解剂有不同的抗性,溶解细菌前需先取少量菌悬液,加一定浓度的溶解剂,看是否能溶解菌体。若SDS和溶菌酶均能溶解菌体 ,最好使用既廉价又能抑制DNase的SDS;若需用溶菌酶应加入SDS促进溶菌;如果60℃溶菌过程缓慢,可将温度提高到70～75℃;有些菌也可用脱氧胆酸盐破裂细胞膜溶解菌体。对溶解剂有抗性的菌类,可在含青霉素或甘氨酸的培养基中培养,使其不形成细胞壁。如SDS和酶破壁效果不理想,可同时用反复冻融、超声波或氧化铝和玻璃粉研磨辅助破壁。 |
7楼2009-10-13 10:35:13
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