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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » EcoRI酶为何切不开？
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yf-deng

金虫 (正式写手)

[交流] EcoRI酶为何切不开？

大家好！我最近在做AFLP，刚开始酶切就不顺利。采用EcoRI/MseI酶切组合，两种酶的单酶切和双酶切结果对照发现EcoRI没有切动。为此：
试用了TaKaR和fermentas的EcoRI对基因组进行单酶切（采用不同的酶量，不同的酶切时间和不同的buffer组合），但仍然无法切开。
之后，又对DNA抽提方法进行改进（用了盐析法和酚氯法）抽提DNA，仍无法切开。
所以我有以下疑问：
1、模板DNA的应该可确定没有问题（MseI切的很好），难道是基因组本省EcoRI酶切位点极少？
2、目前我做的这个生物有两篇AFLP的报道，采用的EcoRI/MseI双酶切组合，他们的结果会不会是仅仅是MseI单酶切的结果，因为其他的原因，我不方便和这两篇文章的作者联系。

我的对策：
1、买NEB的EcoRI试试
2、若还切不开，只好换用酶切组合（这需要对该生物现有序列的分析来确定其基因组大致的GC含量，为此我专门发了个帖子请问大家可有比较方便的在线工具或软件来分析序列的GC含量）

恳请大家提出宝贵意见！非常感谢！
下图靠近marker的三个是不同buffer的EcoRI酶切结果，最边上是基因组DNA

[ Last edited by yf-deng on 2009-9-22 at 16:19 ]
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1楼 2009-09-21 10:35:18
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yf-deng

金虫 (正式写手)
请大家帮忙呀！
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2楼2009-09-21 10:49:38
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小瞥

铁虫 (小有名气)
★
yf-deng(金币+1):谢谢参与
两种组合的酶是不是所用的buffer不同，这直接影响酶切效率
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3楼2009-09-21 12:10:33
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yf-deng

金虫 (正式写手)
有通用的buffer和专用的buffer都试过，还是不行呀！
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4楼2009-09-21 17:37:03
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spiderboy

金虫 (正式写手)
★
yf-deng(金币+1):谢谢参与
EcorI应该是很常用的，应该比较好切，切不出来最好还是查下你的目的片段上面的序列是不是发生位点突变了或者甲基化什么的，才导致切不开
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5楼2009-09-21 23:29:55
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mascotte

金虫 (正式写手)
★
yf-deng(金币+1):谢谢参与
一、酶的问题，可以做个对照试验，看看酶能不能切开含有EcoR I酶切位点的质粒，鉴定一下酶的效果；
二、DNA的问题，DNA里含有酒精，蛋白都会干扰酶切反应，如果污染了就需要用酚氯仿抽提，乙醇沉淀，干燥之后再溶解。干燥的时候不要让DNA干过头，不然不易溶解也切不动。

[ Last edited by mascotte on 2009-9-22 at 03:57 ]
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6楼2009-09-22 03:55:50
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zc450zc

金虫 (正式写手)
★
yf-deng(金币+1):谢谢参与
应该做个对照试验啊
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7楼2009-09-22 07:05:18
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caiqingchong

木虫 (著名写手)
★
yf-deng(金币+1):谢谢参与
换酶没有必要，可以找其他原因
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8楼2009-09-22 08:25:14
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caiqingchong

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
fermentus的酶相当好用，可以切一下其他片段，验证下酶的效果，切动的话就不是酶的原因
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9楼2009-09-22 08:26:12
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huangdi07

铁杆木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
学习了，但是我感觉一个基因组里不可能连一个EcoRI位点都没有吧
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10楼2009-09-22 08:26:31
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