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dengzelin520

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[交流] 多糖提取纯化检测交流请教

最近在提取分离植物里面的多糖，刚接触，很多不明白的地方，请做过的指教指教啊。
1. 提取的粗多糖先用3kDa的透析膜去小分子，但是换了几次水，透析了三天，得到的粗多糖颜色还是非常的深，请问这个颜色是什么物质带来的呢？我觉得多糖应该不会带颜色吧？
2. 粗多糖采用苯酚硫酸法测糖含量，再用硫酸-间羟基联苯法测酸性糖含量；这里苯酚-硫酸法测的糖含量是包括中性糖和酸性糖一起的总含量吗？
3. 在用DEAE分离中性糖和酸性糖的时候，用的55mm*350的柱子，上样样品20mg/mL，浓度再高就溶不了了，总的上样量怎么算呢，比如能上几百毫克？怎么上样比较合适？分离得到了5个组分，但是SEC-RI测了后都不是对称峰。DEAE分完后有大量的颜色洗脱不了，是小分子吗？
4. 再用Sephacry S200继续分离，柱子26mm*60mm，这个Sephacry是中性糖和酸性糖都可以分离吗？洗脱后收集80管，苯酚硫酸测后绘制洗脱曲线，怎么根据这个洗脱曲线合并馏分呢？因为合并的管子越少，组分应该越纯，但是丢的糖就多了。
5. 用DEAE和Sephacry分离后的回收率都很低，只有30%左右，其他的糖去哪里了呢？用高浓度的氯化钠后面洗脱出来的滤液也测不到糖了。得到的酸性糖还是带颜色的，为什么会有颜色呢？

谢谢，有好多不懂的，实验室之前也没有人做过，搞的头都大了

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1楼 2022-12-13 16:49:59

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yyjfree

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dengzelin520(金币+1): 谢谢参与

1、多糖尤其天然多糖很多是杂合的，带颜色很正常，仅仅靠透析脱色不现实，要么靠层析和沉淀反复提纯除去色素以及和色素键合的多糖，牺牲收率，要么就得化学脱色。
2、硫酸苯酚法包括中性糖和酸性糖，但是单位质量酸性糖和中性糖显色强度不同，所以首先得羟基联苯法测出来糖醛酸而用此数据去配置相应浓度的糖醛酸标准液校正硫酸苯酚法的测定结果，还有就是硫酸苯酚法测定中性糖如果要准确也不能用葡萄糖，而是要首先测定中性糖的组成糖，根据各单糖残基的比例配置相应对照品。
3、上两量就是你上的糖总量啊，体积乘浓度，一个制备柱一个分析柱，测定结果不对称峰很正常，取峰最主要部分反复纯化才能得到单一对称峰。
4、Sephacry S200属于凝胶柱主要原理是分子量分离，用来分离中性糖和糖醛酸效果不好，DEAE可以。
5、回收率的计算如果是中性糖则应该以糖的总量去计算，不能用物质总量计算，同理糖醛酸也是。即测定样品中总多糖含量，用纯化后得到多糖量除以之前的多糖量。

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10楼2023-01-09 21:23:00

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从零_开始

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dengzelin520(金币+1): 谢谢参与

1、多糖有色素很正常的，可以在前处理上下一点功夫，尤其是叶片类可以用不同类型的有机溶剂（比如无水乙醇、石油醚）脱掉一部分再进行提取。后期可以用大孔树脂处理，药用活性炭也可以试试，也有用过氧化氢的但是容易破坏多糖的抗氧化活性个人不太建议。
2、DEAE柱子上样浓度太高了，一般来说浓度低更容易分离的彻底，我个人通常用到5mg/mL，每次上样20ml左右。这可能也是影响后面洗脱颜色重和回收率不高的一个原因，不对称峰可能就是没分离彻底

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11楼2023-01-15 13:47:31

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