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反对派

银虫 (正式写手)

[求助] 逆转录结束后,为何要灭活逆转录酶?

invitrogen公司的M-MLV Reverse Transcriptase进行逆转录疑问:
1. 程序上的问题。37℃ 2min→25℃ 10min→37℃ 50min。 中间这个25℃是起什么作用?
2. 反应结束后为何要70 ℃,15分钟将逆转录酶灭活。
3.逆转录这一步的的成分里面哪些东西会影响后续的 qPCR?
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反对派

银虫 (正式写手)

送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by Endotoxin at 2022-10-02 08:42:27
关于要灭活逆转录酶活性还有一个重要原因可能是RT竞争性抑制DNA pol,推测是影响DNA pol结合到cDNA模板。

谢谢!
5楼2023-01-07 11:43:47
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Endotoxin

金虫 (著名写手)

一般逆转录时用的随机引物才会25度。逆转录酶特别是mmlv还有末端转移酶活性,可能会在合成的cDNA末端添加碱基c详细可以参考smart。逆转录产物中的离子,残留引物都可能影响后续扩增,所以一般下一步做PCR的话,逆转录产物最好不要超过PCR反应体系十分之一。

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2楼2022-10-01 23:21:06
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Endotoxin

金虫 (著名写手)

关于要灭活逆转录酶活性还有一个重要原因可能是RT竞争性抑制DNA pol,推测是影响DNA pol结合到cDNA模板。

发自小木虫IOS客户端

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

3楼2022-10-02 08:42:27
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反对派

银虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by Endotoxin at 2022-10-01 23:21:06
一般逆转录时用的随机引物才会25度。逆转录酶特别是mmlv还有末端转移酶活性,可能会在合成的cDNA末端添加碱基c详细可以参考smart。逆转录产物中的离子,残留引物都可能影响后续扩增,所以一般下一步做PCR的话,逆转 ...

谢谢
4楼2022-10-02 12:18:41
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