| 查看: 861 | 回复: 0 | |||
[交流]
动物实验日常操作：小鼠骨髓间充质细胞元代分离
|
|
BMSCs来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，免疫原性低。但是不同的分离培养方法使得BMSCs在体外扩增时的纯度、活性、表型和分化潜能差异很大，导致基础研究结论各异和临床试验效果不一。因此，深入认识BMSCs不同分离方法和培养条件的优缺点，并根据实验目的做出相应选择，是进行BMSCs实验研究的关键环节。 目前用于分离BMSCs的方法主要有五种，分别是贴壁筛选法、骨组织消化法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法和磁珠分选法。 下面向大家详细介绍贴壁筛选法，对初次培养者来说，贴壁法分离BMSCs操作简单易掌握，不易发生污染，是一个较好的分离方法。不足的是分离提取的细胞纯度相对不高。 ✦ 贴壁筛选法 ✦ 贴壁筛选法是利用细胞贴壁时间及贴壁牢固性的不同，逐步将非贴壁细胞和其它杂质细胞去除的一种简单易行的方法，常用于干细胞的培养中，因此用于分离BMSCs最为广泛。 利用BMSCs贴壁生长特性，更换培养液逐步去除漂浮生长的造血系统细胞即可获得较纯化的BMSCs；而且骨髓中的造血干细胞能分泌生长因子和促贴壁物质,可促进BMSCs贴壁生长，贴壁筛选法也常被称为直接培养法或者全骨髓法。 操作步骤 01 以颈椎脱臼法处死SPF级3-4周龄C57BL/6J小鼠或者SD/Wistar大鼠，用75%乙醇浸泡。 02 随后在鼠的腿的位置剪开外皮和内皮，无菌状态下取出双侧股骨和胫骨，浸泡于无菌含双抗PBS溶液中。剔除股骨和胫骨周围的肌肉、结缔组织，用含双抗的PBS溶液清洗三遍。 03 用眼科剪剪去股骨和胫骨的两端，暴露骨髓腔。 04 用注射器以完全培养基反复冲洗骨髓腔直至骨头发白。 05 收集骨髓液，离心，后加入适当培养基（含20%血清）接种于培养基皿中置于37℃，5％ CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养。 06 24-48h后去悬浮，接下来的每3天换液一次，直到需要传代。 延伸阅读 ✦ 骨组织消化法 ✦ 骨组织消化法操作简单、成本低，且获得的BMSCs纯度较贴壁筛选法高，是分离BMSCs较为常用的方法。 操作步骤 01 参照贴壁筛选法上述操作步骤第1-3步，收集冲去骨髓的股/胫骨于无菌的培养皿中，用无菌眼科剪小心地将骨组织剪成约1～3mm3的碎片。 02 之后加入适量含1mg/mL Ⅱ型胶原酶的新鲜完全培养基（含5% FBS），于37℃摇床中振荡消化 。 03 消化结束后离心，弃上清液，用PBS清洗两次，然后将骨碎片接种于培养皿中，加入适量新鲜的完全培养基（含20% FBS）淹没骨碎片，并置于37℃ 5%二氧化碳培养箱中培养。 04 培养至72h后进行首次半量换液。此后每3天换一次液。待贴壁细胞达到80%~90%融合，进行细胞扩增传代。 使用骨组织消化法分离BMSCs也并非完美，II型胶原酶的消化可能影响BMSCs活性及增殖能力。 |
回复此楼» 猜你喜欢
横向课题结题时企业突然问专利归谁，合同里没约定的话默认算谁的？
已经有22人回复
-
教师节聊点实在的：很多老师的专利正在悄悄失效
已经有22人回复
-
植物学论文润色/翻译怎么收费?
已经有187人回复
-
第一次独立答复专利审查意见，才发现这活跟毕业答辩是一个套路
已经有24人回复
-
使用QE质谱仪检测杂质含量
已经有0人回复
-
帮学院整理搁置专利清单时发现一半快到年费期，聊聊几条盘活的路子
已经有19人回复
-
师弟论文见刊大半年才想起来申请专利，还能抢救一下吗？
已经有8人回复
-
实验室折腾了三年的自制设备要不要申请专利？跟导师争了一晚上没吵明白
已经有11人回复
-
入职后第一次管课题组的专利缴费，对账才发现官费比别人多掏了一倍
已经有6人回复
-
搬家整理出五年前的失败实验记录，导师说这些"废数据"先别扔
已经有3人回复
