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新虫 (小有名气)

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[交流] 酵母DNA提取——诡异的结果

我已提了好几次酵母基因组DNA，但每次都出现诡异的情况。我采用石英砂法和蜗牛酶两种方法。采用蜗牛酶法时，在1500bp位置出现两条带。采用石英砂法时，在20000bp, 6000bp和2000bp的位置出现条带，总共有三条带。不知是什么原因造成的，当初怀疑是蜗牛酶的问题，所以采用石英砂法，但还是出现多条带。这两种方法和文献中的方法基本上是一样的。

请各位虫友看看是什么原因造成的，或提供一些好的酵母DNA提取方法。
在此谢过！以下是提DNA的具体方法。

一、石英砂法
① 5000rpm×5min 收集过夜培养的菌体（5ml左右），于 200μL 裂解液(50 mmol/ L Tris-HCl pH 8.0 , 180 mmol/ L EDTA pH 8.0 , 1 % SDS , 现配)中，加入 3/10 总体积石英砂在涡流混合器上振荡 13min，每隔 4min 将离心管取出用力甩几下，然后 65℃水浴 10min。
② 加入 200μL 5mol/L KAc，冰浴 8min；
③ 12000rpm×5min 转移上清至新的离心管中；
④ 加入 3 mol/L NaAc 35ul，加入异丙醇 200μL 混匀后冰浴 8min，12000rpm×5min收集沉淀；
⑤ 200μL TE 溶解，加入 RNase 10μL，65℃水浴 10min；
⑥ 加入 200μL 氯仿－异戊醇（24:1）,抽提；
⑦ 温柔地取上清 150μL ，加入 20μL 3 mol/L NaAc 及 375μL 无水乙醇，混匀后12000rpm×8min 收集 DNA；
⑧ 70% 乙醇洗涤沉淀，吹干后 TE 溶解，-20℃保藏。

二、蜗牛酶法
1. 接种于5 ml的YEPD培养基中在25℃-28℃振荡培养12-16 h。
2. 3500 rpm离心5min沉淀细胞，用1ml 的无菌水洗涤一次，再加0.5ml solution Ⅰ(1M 山梨醇，0.1M EDTA, pH=7.5)重悬。
3. 转移细胞至1.5 ml 的离心管中，加入0.1蜗牛酶 (30mg/ml)溶液，37℃保温30-60min, 以获得原生质体。
4. 最大转速离心1min以沉淀细胞，用500ul solutionⅡ(50mM Tris-HCl, 20mM EDTA, pH=7.4)溶液悬浮，然后加入50ul 10% SDS, 混合65℃保温30min。
5. 加入200ul 5M 醋酸钾，放于冰上30 min。
6. 最大转速离心15min，转移上清液至新的离心管中，用等体积的异丙醇沉淀DNA。
7. 室温下放置5min，离心10min，用70%的乙醇洗涤一次，真空干燥，用50ul pH=7.4 TE溶液溶解。

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1楼2009-09-14 00:05:14

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fushxmy

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★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流

我给你提供一个方法吧，是我们实验室常用的：
1、先配一个破菌缓冲液：
Triton X-100 2％（v/v） SDS 1％（w/v）
NaCl 100mM Tris•HCl（pH 8.0） 10mM
2、把酵母细胞离心收集，加入200ul的破菌液再加200ul的酚氯仿，vortex一分钟，放在冰上一分钟，一共反复4次
3、加入500ul的ddH2O，vortex，离心，抽上清和等体积的酚氯仿混合
4、vortex，离心，抽上清和等体积的酚氯仿混合
重复4直到离心后两层之间没有蛋白出现
5、抽上清加1ml的无水乙醇，放在-20度30min
6、离心，抽上清，再用70%乙醇洗一次，真空干燥，用TE或ddH20溶解

此法我用了好几年均很正常，酵母基因组提起来很粗糙，但是很好使。