| 查看: 574 | 回复: 0 | |||
[交流]
小鼠骨髓间充质细胞元代分离的两种方法
|
|
贴壁筛选法 ✦ 贴壁筛选法是利用细胞贴壁时间及贴壁牢固性的不同，逐步将非贴壁细胞和其它杂质细胞去除的一种简单易行的方法，常用于干细胞的培养中，因此用于分离BMSCs最为广泛。 利用BMSCs贴壁生长特性，更换培养液逐步去除漂浮生长的造血系统细胞即可获得较纯化的BMSCs；而且骨髓中的造血干细胞能分泌生长因子和促贴壁物质,可促进BMSCs贴壁生长，贴壁筛选法也常被称为直接培养法或者全骨髓法。 操作步骤 01 以颈椎脱臼法处死SPF级3-4周龄C57BL/6J小鼠或者SD/Wistar大鼠，用75%乙醇浸泡。 02 随后在鼠的腿的位置剪开外皮和内皮，无菌状态下取出双侧股骨和胫骨，浸泡于无菌含双抗PBS溶液中。剔除股骨和胫骨周围的肌肉、结缔组织，用含双抗的PBS溶液清洗三遍。 03 用眼科剪剪去股骨和胫骨的两端，暴露骨髓腔。 04 用注射器以完全培养基反复冲洗骨髓腔直至骨头发白。 05 收集骨髓液，离心，后加入适当培养基（含20%血清）接种于培养基皿中置于37℃，5％ CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养。 06 24-48h后去悬浮，接下来的每3天换液一次，直到需要传代。 骨组织消化法 ✦ 骨组织消化法操作简单、成本低，且获得的BMSCs纯度较贴壁筛选法高，是分离BMSCs较为常用的方法。 操作步骤 01 参照贴壁筛选法上述操作步骤第1-3步，收集冲去骨髓的股/胫骨于无菌的培养皿中，用无菌眼科剪小心地将骨组织剪成约1～3mm3的碎片。 02 之后加入适量含1mg/mL Ⅱ型胶原酶的新鲜完全培养基（含5% FBS），于37℃摇床中振荡消化 。 03 消化结束后离心，弃上清液，用PBS清洗两次，然后将骨碎片接种于培养皿中，加入适量新鲜的完全培养基（含20% FBS）淹没骨碎片，并置于37℃ 5%二氧化碳培养箱中培养。 04 培养至72h后进行首次半量换液。此后每3天换一次液。待贴壁细胞达到80%~90%融合，进行细胞扩增传代。 使用骨组织消化法分离BMSCs也并非完美，II型胶原酶的消化可能影响BMSCs活性及增殖能力。 |
回复此楼» 猜你喜欢
怎么查看固定段11位
已经有5人回复
-
可以准确的通过filecode判断基金中还是不中。
已经有15人回复
-
植物学论文润色/翻译怎么收费?
已经有82人回复
-
感觉普通人已经没办法玩了，躺平是唯一的出路。
已经有26人回复
-
江苏省优青门槛
已经有20人回复
-
心好累。今年我们部门提交了18个项目。中了11了，可惜我的又挂了
已经有10人回复
-
面上项目计划书
已经有7人回复
-
面上项目计划书附件
已经有9人回复
-
面上项目计划书系统状态
已经有18人回复
-
NSFC-UNEP（与联合国环境规划署）合作项目
已经有33人回复
-
和伊朗人合作
已经有32人回复
