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无缝克隆连不上
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用的维诺赞的C112无缝克隆试剂盒，不太清楚问题出在哪了，载体酶切胶回收浓度28ng/ul，片段特意条带柱回收33.8ng/ul，按说明书用的1:2比例（0.03:0.06pmol），37度pcr仪反应30min，冰上冷却就转化了，用的takara的DH5a，冰浴30min，45s热激，冰浴2min，无抗soc摇1h，5000rpm离心5min，留100ul重悬涂板。 最后没有一个克隆长出来。 设计的引物F端的15bp同源臂GC含量高一点有67%，R端刚好40%，不知道是不是问题在这，或者说感受态转化效率的问题，把热激时间提高到90s？或者说把重组时间提高到1h？ 再或者说重新设计F端同源臂，我看了22bp的同源臂才是低于60%GC @youlinglyw 发自小木虫IOS客户端 |
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