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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 无缝克隆连不上
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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Milkttttea

新虫 (初入文坛)

[求助] 无缝克隆连不上

用的维诺赞的C112无缝克隆试剂盒，不太清楚问题出在哪了，载体酶切胶回收浓度28ng/ul，片段特意条带柱回收33.8ng/ul，按说明书用的1:2比例（0.03:0.06pmol），37度pcr仪反应30min，冰上冷却就转化了，用的takara的DH5a，冰浴30min，45s热激，冰浴2min，无抗soc摇1h，5000rpm离心5min，留100ul重悬涂板。
最后没有一个克隆长出来。
设计的引物F端的15bp同源臂GC含量高一点有67%，R端刚好40%，不知道是不是问题在这，或者说感受态转化效率的问题，把热激时间提高到90s？或者说把重组时间提高到1h？
再或者说重新设计F端同源臂，我看了22bp的同源臂才是低于60%GC

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1楼 2022-08-20 15:27:27
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Milkttttea

新虫 (初入文坛)
但是说明书上建议的同源臂式15-20bp，40%-60%GC，所以很纠结

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2楼2022-08-20 15:32:02
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fengxueren

新虫 (正式写手)
同源臂TM值不要差太多

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3楼2022-08-20 16:38:21
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蘑菇张

新虫 (小有名气)
请问您的问题解决了嘛，我也遇到了同样的困扰，想请教一下
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4楼2022-12-03 09:30:58
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