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求助有关基因测序问题
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我刚上研二，关于课题的事实在没多少主意，望哪位高手指点一下！ 我的课题是研究一株烟曲霉合成胶霉毒素的基因，现在可以从NCBI上可下载到与其他种属比对得出的预测序列，请问要怎么样测序的！师姐建议我把这12个序列用cLUSTALX比对后，设计引物，PCR，然后测序，总感觉行不通呢！哪位有好主意啊，非常感谢！ |
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race
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RACE(rapid-amplification ofcDNA ends)是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。 cDNA完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基因功能的研究至关重要。 完整的cDNA 序列可以通过文库的筛选和末端克隆技术获得。 近年来随着生物技术的不断发展，出现了许多新基因的方法和手段，如图谱技术、转座子标签技术、mRNA差异显示技术二减法技术以及cDNA文库筛选技术等。但上述方法人多具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量大等特点。cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3’末端的有效方法，以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。 经典的RACE技术是由Frohman等(1988)发明的一项技术，主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA5’和3’端，包括单边PCR和锚定PCR。该技术提出以来经过不断发展和完善，克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点(Frohman等,1995:Schaefer,l995: Chen,1998: Bespalova等,1998: Matz等11999)。对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进:改进之一是利用锁定引物((lock docking primer)合成第一链cDNA,即在oligo(dT)引物的3'端引入两个简并的核苷酸【5'-Oligo(dT)16_30MN-3', M=A/G/C;N=A/G/C/T】，使引物定位在poly(A)尾的起始点，从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo(dT)与poly(A)尾的任何部位的结合所带来的影响;改进之二是在5‘端加尾时，采用poly(C)，而不是poly(A);改进之三是采用RNase H一莫洛尼氏鼠白血.病毒(MMLV)反转录酶或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温h (60 度 -70度 )有效地逆转录mRNA，从而消除了5‘端由于高GC含量导致的mRNA 二级结构对逆转录的影响;改进之四是采用热启动PCR (hot start PCR)技术和降落PCR(touch down PCR)提高PCR反应的特异性。 随着RACE技术日益完善，目前己有商业化RACE技术产品推出，如CLONTECH的MarathoTM技术和SMART TM RACE技术术。邢桂春等(2001)先后使用上述两种盒进行RACE反应，结果发现使用Marathon TM所得到的片断总是比采用SMARTsup]TMRACE盒到所得到的片断短。其原因在于Marathon TM技术反转录反应往往不能真正达到mRNA的5’末端。所以认为，进行RACE反应应当优选SMARTTM RACE盒。以下就国内目前应用最广的SMART TM RACE盒为例，简要概述RACE技术的原理和操作过程。 SMARTTM 3‘-RACE的原理是:利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以连有SMART寡核营酸序列通用接头引物的Oligo(dT)30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA。然后用一个基因特异引物GSP1(gene specific primer,GSP)作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universal primer,UPM)作为下游引物，以cDNA第一链为模板，进行PCR循环，把目的基因3‘末端的DNA片段扩增出来。 RACE的优点 与筛库法相比较，有许多方面的优点 1）此方法是通过PCR技术实现的，无须建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有利用价值的信息。 2）节约了实验所花费的经费和时间。 3）只要引物设计正确，在初级产物的基础上可以获得大量的感兴趣基因的全长。 实验室现有的RACE试剂盒的简介 RACE是一种从一个相同的cDNA模板进行5‘和3‘末端快速克隆的方法。此方法会产生较少的错误条带。此过程中使用的酶混合物非常适合长链PCR。 使用此方法的要求是必须知道至少23－28个核苷酸序列信息，以此来设计5’末端和3‘末端RACE反应的基因特异性引物（GSPs）。 RACE引物的设计： 基因特异性引物（GSPs）应该是： 23－28nt 50－70％GC Tm值≥65度，Tm值≥70度可以获得好的结果 需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE反应的基因特异性引物（GSP1和GSP2).由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。 反应中涉及到的一些事项 cDNA的合成起始于polyA+RNA。如果使用其它的基因组DNA或总RNA，背景会很高。 RACE PCR的效率还取决于总的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸温度。 在进行5‘和3’RACE PCR的时候应该使用热启动。 表4中给出了所有引物的相互关系。重叠引物的设计会对全长的产生有帮助。另外，重叠的引物可以为PCR反应提供一个对照。并不是绝对的要利用设计的引物产生重叠片段。 引物GSP中的GC含量要在50－70％之间。这样可以使用降落PCR。避免使用自身互补性的引物序列，否则会产生回折和形成分子内氢键。另外，避免使用与AP1互补的引物，尤其是在3‘末端。 如果要用重叠片段来检测设计的引物，GSp1和GSp2之间至少是100－200碱基。只有这样才可以用扩增的产物来鉴定设计的引物是否正确。 降落PCR可以明显的增加RACE PCR产物的特异性。在最开始的循环中，退火温度高于AP1引物的Tm值，可以增加对特异性条带的扩增。随后的退火和延伸的温度降回到AP1的温度，可以进行随后的PCR循环。 验证基因特异性引物的对照： 单个引物的阴性对照：只用一个引物GSP来进行阴性对照。这样不应该产生任何的条带。如果可以看到明显的产物，应该改变循环的参数，或重新设计原始引物。 利用两个GSPS进行阳性对照：（只有两个GSP可以产生重叠的时候才可以采用此步。）为了确定RNA样品中目的基因确实表达，利用两个GSP和接头连接的cDNA来产生阳性对照。可以产生两个引物之间的重叠大小的片段。如果没有这个片段，应该重复cDNA的合成，或者从一个不同的组织或细胞来源进行cDNA的合成。 制备和抽提polyA+RNA 不要使用DEPC处理过的水。 纯化完mRNA之后，利用琼脂糖凝胶电泳检测mRNA的质量。哺乳动物的mRNA样品是0.5－12kb的拖带，在其中有4.5和1.9kb的rRNA的条带。非哺乳动物的mRNA应略小 具体的实验步骤 cDNA第一条链的合成： 我们建议进行cDNA合成的对照反应，这样可以对样品的cDNA的合成进行鉴定。加入各种试剂之后，在气浴中42度保温一个小时。 注意：在水浴或酒精浴中保温回减少反应体积，从而降低第一链的合成效率。 将管放于冰上，以终止第一链的合成反应。 直接进行第二链的合成。 cDNA第二链的合成： 第二链合成的酶混合物中，含有聚合酶、RNaseH和连接酶。T4 DNA聚合酶的功能是补平dscDNA的末端。我们建议做阳性对照，试剂盒中提供人类骨骼肌的mRNA。 建议进行阳性对照,cDNA的质量取决于制备的polyA+RNA的质量。非哺乳动物样品的mRNA大约在0.5－3kb之间。 通过电泳检测cDNA的产量，与对照进行对比，这样可以有利于在以后的步骤中对cDNA进行稀释。 接头的连接及连接产物的稀释 按照程序进行连接反应。 如果没有对比样品和对照的产量，利用Tricine－EDTA buffer制备接头连接的dscDNA的1/50和1/250的稀释物，用两种稀释物进行以下的RACE PCR反应，直到鉴定出哪一种稀释可以得到好的效果。 RACE RACE－－PCRPCR扩增扩增 •进行5’和3’的RACE－PCR扩增。 •利用以下的程序进行降落PCR反应： 94度30秒 5个循环：94度5秒 72度4分 5个循环：94度5秒 70度4分钟 20－25个循环：94度5秒 68度4分钟 注意： 我们建议使用降落PCR反应，这就要求GSP的Tm值≥70度。 当循环结束时，利用1.2%琼脂糖凝胶电泳分析每一个管中的产物5μl，使用适当的分子量marker。 •可以根据你的基因的特异性来设计最理想的循环参数。如果看不到带或者只有微弱的带，在68度多加5个循环。最佳的延伸时间取决于扩增条带的长度。如果片断的长度在2－5kb的时候，经常使用4min，0.2-2kb的时候将延伸时间减到2－3min，对于5－10kb的条带，延伸时间增加到10min。 RACE产物的验证： 应该对RACE的片段进行验证,以此来确定是否已经扩增了理想的产物。如果得到的是多条带或者研究的是多基因家族的成员，验证是非常有用的。 有3种验证RACE产物的方法： （1）比较由GSP和NGSP获得RACE产物。 （2）Southern blot （3）克隆并测序 我们建议最好测得RACE产物的部分序列。有的时候需要嵌套引物的存在。 比较由GSP和NGSP获得RACE产物。 对于5‘末端的RACE产物，比较由AP1和GSP1扩增出来的产物和由AP1和NGSP1扩增出来的产物。 对于3‘末端的RACE产物，比较由AP1和GSP2扩增出来的产物和由AP1和NGSP2扩增出来的产物。这对于鉴定多条带是否是上一个PCR的特异性产物是非常有用的。 如果条带是正确的，在嵌套PCR反应中的条带应该是略微小一些。基本PCR和嵌套PCR产物的迁移率的不同取决于ｃＤＮＡ结构中GSP1和嵌套引物的位置。 RACE产物的克隆和测序： 可以利用胶回收试剂盒来回收RACE产物，此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物；对于长的片段，可以通过电洗脱获得好的结果。如果你选择使用其他的纯化方法，最后用Tricine－EDTA buffer 30μl重新悬浮DNA样品。 电泳5μl回收的样品来鉴定回收的质量。 将回收的PCR产物直接克隆到/A型的PCR克隆载体中。另外还可以利用接头和/或cDNA合成引物中的Not1、Srf1、Xma1、ECOR1等酶切位点，将产物克隆到常规载体中 对于5‘端的RACE产物，我们建议挑取至少8－10个不同的克隆以获得5‘端的最大可能性的序列。（反转录并不总是进行到mRNA模板的5’末端，尤其是长模板。另外，T4 DNA聚合酶会移走5‘末端的0－20个碱基。） 一旦鉴定了含有插入片断的克隆，应该获得多的序列信息。理想的是，可以对整个开放读码框进行测序。包括5‘和3‘的非翻译区。 全长cDNA的获得 通过部分或全部测序鉴定了RACE产物后，可以通过两种选择获得全长的cDNA。 通过PCR的方法。 通过克隆的方法。 通过PCR的方法获得全长cDNA： 扩增长的cDNA需要较长的延伸时间，但是如果延伸的时间过长，可以产生拖带，所以要慎重的设计引物。 根据从5‘和3‘RACE产物获得序列信息设计5’和3‘GSP引物。这些引物应该来自cDNA的3’或者5‘的末端，应该是23－28nt长。不应该在引物的末端加上限制性位点，这样会导致高背景。在某些时候可以设计3’和5‘的嵌套引物。但是还是应该先利用一对引物进行PCR反应。 通过PCR的方法获得全长cDNA： 进行如下的热循环： 94度30秒 25个循环94度5秒 72度2－15分钟 延伸的时间应该等于预期的cDNA长度加上2分钟。例如：预期得到6kb的条带，用6＋2＝8分钟的延伸时间。 注意：如果没有条带或者条带弱，增加5个循环；或者优化PCR的条件。 通过PCR的方法获得全长cDNA： 在1.2%的琼脂糖凝胶上分析5μl的样品。通常情况下，可以见到一条单一带，如果这样，利用胶来纯化全长的cDNA。 制备1.2%的TAE buffer制备琼脂糖凝胶。不使用TBE buffer，TBE的胶很难制备全长的cDNA。 将剩下的45μl反应物点样，选用适当的marker。 利用长波紫外观察cDNA（≧300nm）切下全长的cDNA。注意：应该尽量减少紫外对cDNA的照射。 通过PCR的方法获得全长cDNA： 利用胶回收试剂盒回收cDNA。此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物；对于长的片段，可以通过电洗脱获得好的结果。如果你选择使用其他的纯化方法，最后用Tricine－EDTA buffer 30μl重新悬浮DNA样品。 将全长的cDNA克隆到T/A型的PCR克隆载体中。 通过克隆产生全长的cDNA： 如果你已经获得了含有重叠部分的5‘和3’RACE产物，同时在cDNA的重叠部分含有一个酶切位点的话，通过克隆技术可以获得全长的cDNA。 利用酶切获得的3‘和5’扩增产物，并且利用T4 DNA连接酶将它们连接起来。利用接头和cDNA合成引物中的内切酶将最终的全长cDNA克隆到载体中。 在哺乳动物基因组中，NOT1和Srf1酶切非常稀少，大约106bp才出现一次，因此在绝大多数的cDNA中是不出现的。 Appendix：cDNA接头和引物接头在设计的时候可以使cDNA的扩增成功进行：接头的5‘端在第一个循环中没有AP1引物的结合位点。AP1的结合位点只有通过GSP的扩增之后才能够产生。这些特点中的每一个都可帮助减少cDNA片段扩增过程中出现的非特异性扩增。另外，它们允许从一个复杂的DNA片段的混合物中扩增出靶样品――所有的产物都有相同的末端结构，因为使用了单一的一套GSPs |
6楼2009-09-18 18:52:54
2楼2009-09-11 10:35:41
生命核心
木虫 (正式写手)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 贵宾: 0.1
- 金币: 2290.5
- 散金: 10
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- 在线: 140.2小时
- 虫号: 317932
- 注册: 2007-03-04
- 性别: GG
- 专业: 基因组学
3楼2009-09-11 15:44:06
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