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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » [求助] 克隆cDNA出了问题。
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erictan2046

铜虫 (正式写手)

[交流] [求助] 克隆cDNA出了问题。

我想请问一下，我提取总RNA之后，立即做反转录ｃＤＮＡ第一条链的合成，然后就PCR，我设计的引物是从起始密码子和终止子结束的！PCR有非特异性条带~~~但是有一条是和Marker的相应位置大小是一样的~我把它切下来回收后，测序居然是不对的？？？我想请问一下，是什么原因出错呢？？？
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1楼 2009-09-11 09:26:17
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gastrodia

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
请问你的退火温度是多少？退火温度低，扩出来的非特异性就不好
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2楼2009-09-11 09:28:55
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anik

银虫 (正式写手)
引物呢？特异性与否？
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3楼2009-09-11 10:39:44
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yxhan7113

金虫 (小有名气)
★
生命核心(金币+1,VIP+0):谢谢回帖交流 9-11 15:53
1. PCR选择合适的条件特别是退火温度，得到特异性的条带
2. 由于DNA自身会形成某些二级结构，在胶上显示的条带大小会和实际的大小有误差
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4楼2009-09-11 11:04:16
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heismeng

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
设计好的primer
gradient PCR 寻找合适的annealing T
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5楼2009-09-11 13:37:42
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haosmile

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
应该需要提高退火温度吧
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6楼2009-09-11 15:48:51
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habio
7楼2009-09-11 15:57:21
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changes

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
设计的引物去NCBI比对过吗？不知该引物对应的基因表达丰度如何？
直接PCR扩增获得该基因可能比较难。
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8楼2009-09-11 16:32:28
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