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【求助】金葡菌生物被膜的结晶紫半定量实验测得OD值很低 已有1人参与
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【求助】金葡菌生物被膜的结晶紫半定量实验测得OD值很低 小弟最近在做细菌生物被膜的实验，因为并不是生物专业，所以好多基础的问题都不太会。现在是半定量结晶紫染色的结果一直不明朗，还请各位大佬解答一下，结果配图。实验步骤如下： 1.将冻干粉金黄色葡萄球菌CMCC26003用复苏溶液溶解，吹打均匀后将其接种到TSA培养基上37℃过夜培养。 2.传代到第四代 3.将TSA培养基上的单个菌落（第四代）接种到TSB培养基上，50r/min，37℃，摇菌过夜 4.将菌液吸出，分次少量加入TSB溶液，取100ul到96孔板中，测吸光度结果，直到酶标仪结果为OD600=0.5（用平板计数法测得菌的浓度在109CFU/mL左右） 5.稀释到106 ，加200ul菌液到96孔板（聚苯乙烯，TC处理）中，37℃，静置培养24H。 6.将菌液吸出（颜色由刚开始的澄清变浑浊）后，用PBS缓冲液冲洗三次，晾干 7.加入200ul甲醇，固定30min后弃掉甲醇，用三蒸水清洗三次，晾干 8.加入200ul0.1%结晶紫溶液，染色15min，用三蒸水将多余染料清洗干净（清洗3-4次）晾干（这个时候效果就不好了，壁上几乎没有，底部若有如无） 9.加入200ul33%乙酸，静置1h后测OD595酶标仪结果，结果在0.08左右 文献中的酶标仪结果都是我结果的几倍，甚至是十几倍，染色后颜色也比我的深非常多。苦于这个结果太久，做到现在已经不知道该怎么改进实验了。今天又怀疑是TSB溶液的原因，我用的是青岛海博的胰酪大豆胨液体培养基（TSB）。跪求做过此种实验的大佬解答！ 配图是刚染完色之后。  微信图片_20220704152708.jpg |
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