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哈哈嗯哼

新虫 (小有名气)

[交流] 求大佬给分析一下pcr失败的原因 已有5人参与

我用的kod fx酶,扩增的目的基因大小大约9kb左右,按照酶的使用说明书设置的pcr程序,加的各种试剂也是按照说明书来的(没有镁离子),但是跑完胶没有我要的目的基因(引物是找公司设计的),是提的DNA有问题吗?

求大佬给分析一下pcr失败的原因


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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲,勿施于人


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扩增9000bp这是啥基因呀?这么长确实不容易成功,对模板质量要求较高。
模板加了多少?从基因组dna做的pcr还是从逆转录的cdna做的pcr?单从琼脂糖胶的图来看,非特异性扩增产物太多。
The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
2楼2022-06-05 21:48:21
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哈哈嗯哼

新虫 (小有名气)

做的是小麦的基因,用ctab粗提的DNA,加入各试剂和模板以及pcr程序是完全按照kod  fx酶的说明书来的,加模板的量1微升

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3楼2022-06-06 20:04:27
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哈哈嗯哼

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2022-06-05 21:48:21
扩增9000bp这是啥基因呀?这么长确实不容易成功,对模板质量要求较高。
模板加了多少?从基因组dna做的pcr还是从逆转录的cdna做的pcr?单从琼脂糖胶的图来看,非特异性扩增产物太多。

我怀疑是是因为体系里没有镁离子,但是我的导师说他一直用的kod fx酶扩增,从来不加镁离子,成功率挺高的,难不成pcr真的是玄学吗

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4楼2022-06-06 20:07:13
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中科科翼19

禁虫 (初入文坛)


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本帖内容被屏蔽

5楼2022-06-09 11:37:55
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fengxianp

新虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by 哈哈嗯哼 at 2022-06-06 20:07:13
我怀疑是是因为体系里没有镁离子,但是我的导师说他一直用的kod fx酶扩增,从来不加镁离子,成功率挺高的,难不成pcr真的是玄学吗
...

一般都是加Mg离子,这样效果会好点

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6楼2022-07-11 11:03:21
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金虫 (小有名气)


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一般情况下除非用质粒等当模板,否则直接从较大的基因组扩增大片段本身就很难,这个没什么,从新设计引物试试,实在不行就分段扩增,引物设计的时候一般尽量Tm值大点,60度左右,太低的话个人认为不是很好用
7楼2022-07-20 16:09:58
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ap372767129

铁虫 (正式写手)


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9000 bp基因一般分三段或四段来P,每段的正反向引物的Tm值分别设置成60,然后用无缝克隆试剂盒连接(同源重组)。要用高保真PCR聚合酶,不要Taq酶。
8楼2022-08-03 17:02:17
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