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哈哈嗯哼

新虫 (小有名气)

[交流] 求大佬给分析一下pcr失败的原因 已有5人参与

我用的kod fx酶，扩增的目的基因大小大约9kb左右，按照酶的使用说明书设置的pcr程序，加的各种试剂也是按照说明书来的（没有镁离子），但是跑完胶没有我要的目的基因（引物是找公司设计的），是提的DNA有问题吗？

求大佬给分析一下pcr失败的原因


求大佬给分析一下pcr失败的原因-1


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求大佬给分析一下pcr失败的原因-3


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1楼 2022-06-05 19:21:53
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人
★
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扩增9000bp这是啥基因呀？这么长确实不容易成功，对模板质量要求较高。
模板加了多少？从基因组dna做的pcr还是从逆转录的cdna做的pcr？单从琼脂糖胶的图来看，非特异性扩增产物太多。
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
2楼2022-06-05 21:48:21
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哈哈嗯哼

新虫 (小有名气)
做的是小麦的基因，用ctab粗提的DNA，加入各试剂和模板以及pcr程序是完全按照kod  fx酶的说明书来的，加模板的量1微升

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3楼2022-06-06 20:04:27
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哈哈嗯哼

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2022-06-05 21:48:21
扩增9000bp这是啥基因呀？这么长确实不容易成功，对模板质量要求较高。
模板加了多少？从基因组dna做的pcr还是从逆转录的cdna做的pcr？单从琼脂糖胶的图来看，非特异性扩增产物太多。

我怀疑是是因为体系里没有镁离子，但是我的导师说他一直用的kod fx酶扩增，从来不加镁离子，成功率挺高的，难不成pcr真的是玄学吗

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4楼2022-06-06 20:07:13
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中科科翼19

禁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
5楼2022-06-09 11:37:55
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fengxianp

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by 哈哈嗯哼 at 2022-06-06 20:07:13
我怀疑是是因为体系里没有镁离子，但是我的导师说他一直用的kod fx酶扩增，从来不加镁离子，成功率挺高的，难不成pcr真的是玄学吗
...

一般都是加Mg离子，这样效果会好点

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6楼2022-07-11 11:03:21
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AD_com

金虫 (小有名气)
★
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一般情况下除非用质粒等当模板，否则直接从较大的基因组扩增大片段本身就很难，这个没什么，从新设计引物试试，实在不行就分段扩增，引物设计的时候一般尽量Tm值大点，60度左右，太低的话个人认为不是很好用
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7楼2022-07-20 16:09:58
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ap372767129

铁虫 (正式写手)
★
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9000 bp基因一般分三段或四段来P，每段的正反向引物的Tm值分别设置成60，然后用无缝克隆试剂盒连接（同源重组）。要用高保真PCR聚合酶，不要Taq酶。
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8楼2022-08-03 17:02:17
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