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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 三酶切
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小猫三两只

金虫 (正式写手)

[交流] 三酶切

实验方案:目的基因连到T载体后,再双酶切连到表达载体上
但目的基因与T载体的片段大小差不多,回收时不好区分,为解决这一问题,见有虫友提议用三酶切的方法将T载体切碎

想问一下,三酶切的酶是如何选择的?是不是其中的两个是目的基因两端的酶,另外一个是T载体上的,但是T载体上的酶不是都在MCS上吗,切开后应该不太会影响到T载体的长度吧,那不还是不好区分吗

呵呵,不知说清楚没!!

[ Last edited by 350784478 on 2009-9-21 at 13:57 ]
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1楼 2009-09-07 21:56:10
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
小猫三两只(金币+2,VIP+0):谢谢 9-7 22:18
1、可以直连表达载体啊~难道遇到很特殊的位点？
2、切碎的意思是位于MCS之外的酶切，只要T切碎了变成小片段而目的基因不会被切断，就区分出来了
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2楼2009-09-07 22:03:01
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小猫三两只

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2009-9-7 22:03:
1、可以直连表达载体啊~难道遇到很特殊的位点？
2、切碎的意思是位于MCS之外的酶切，只要T切碎了变成小片段而目的基因不会被切断，就区分出来了

1直接连了好多次,没连上,才想到往T载体上连的
2那我再找找看有没有合适的酶切位点了
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3楼2009-09-07 22:20:13
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
T在上除了MCS还有一些另外的酶切位点。
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Thank-you，so-blue.
4楼2009-09-07 22:38:12
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greatwall8596

★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
为什么要先连到T载体上？
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5楼2009-09-07 23:18:32
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houjinglhy

荣誉版主 (文坛精英)

表达自由，人权之基。

优秀版主
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
重新设计引物
直接在连好的T载体上PCR就可以了
何必三酶切？
三酶切当然也可以 不过切点得选好 当然不能是MCS上的咯
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从小就学习鲁迅，直到现在才体会到他当时是多么的绝望和无助，却仍要用尽最后一丝力气声嘶力竭的呐喊！
6楼2009-09-07 23:30:28
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小猫三两只

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by greatwall8596 at 2009-9-7 23:18:
为什么要先连到T载体上？

直接连老是连不上,后来听说连T载体比较容易,我们现在都是先往T载体上连,已经连上好几个基因了,就这个跟T载体差不多长,就不太好连
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7楼2009-09-08 15:29:10
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小猫三两只

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by houjinglhy at 2009-9-7 23:30:
重新设计引物
直接在连好的T载体上PCR就可以了
何必三酶切？
三酶切当然也可以 不过切点得选好 当然不能是MCS上的咯

这跟引物也有关系吗,我做的这个是选用基因内部的一段,验证其功能,还要表达蛋白,因此选好后,一般就不会变了,上游就是从ATG开始,下游不能变化太大
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8楼2009-09-08 15:34:27
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小猫三两只

金虫 (正式写手)
自己顶起来,期待结果
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9楼2009-09-08 21:37:11
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louyiceng

荣誉版主 (知名作家)

优秀版主
★
小猫三两只(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
Originally posted by houjinglhy at 2009-09-07 23:30:28:
重新设计引物
直接在连好的T载体上PCR就可以了
何必三酶切？
三酶切当然也可以 不过切点得选好 当然不能是MCS上的咯

谢谢
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10楼2010-03-09 09:31:47
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